2014 Fiscal Year Research-status Report
新規骨分化抑制因子fad104の機能解析と骨関連疾患発症における役割の解明
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26460074
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
西塚 誠 名古屋市立大学, 薬学研究科(研究院), 講師 (00363953)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | FAD104 / 骨分化 / 脂肪細胞分化 / Smad / 骨形成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
骨組織は常にその一部が破骨細胞により吸収され、同時にほぼ同量の新しい骨が骨芽細胞の分化により形成されることにより、恒常性が維持されている。骨芽細胞から骨への分化の異常は、骨粗鬆症をはじめとした骨関連疾患を引き起こす重大な一因となる。そのため、骨分化の分子機構を解明することは、骨分化異常を原因とする疾病に対する有効な創薬開発のために極めて重要である。最近申請者らは、脂肪細胞分化初期に発現が増加する新規遺伝子として単離したfad104が骨分化抑制因子としても機能することを明らかとしたが、その作用機序については不明な点が多い。そこで本年度は、細胞内におけるfad104の作用機序とその発現制御機構に特に注目し、検討を行った。
複数のGST融合fad104欠損変異体を作製した。大腸菌で発現させ、精製したFLAG融合Smad1とのpull down assayの結果、FAD104の161-277アミノ酸がSmad1との相互作用に重要である可能性が示唆された。この領域には、タンパク質相互作用に重要なグリシンリッチ領域を含むことから、グリシンリッチ領域がSmad1との相互作用に重要である可能性が示唆された。
さらに、fad104の発現調節機構についても検討を行った結果、脂肪細胞分化誘導剤の一つであるデキサメタゾンがfad104の発現に重要であることが明らかになった。また、fad104の転写開始点の探索を行った結果、fad104には異なる転写開始点を有するtranscript variantが2種類存在すること、さらに、脂肪細胞分化初期に発現変化を示すのは、transcript variant 1のみであることが明らかになった。
今後、相互作用機構と発現調節機構についてより詳細な検討を引き続き行っていく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、FAD104とSmad1/5/8との相互作用機構とfad104の発現調節機構についていくつかの新しい知見を見出すことができた。骨分化過程におけるFAD104の役割と機構を考えるためには、FAD104の相互作用因子であるSmad1/5/8とどのように相互作用するのか、さらに、Smad1/5/8のリン酸化レベルをどのような機構で抑制するのかについて明らかにすることが必要不可欠である。また、fad104は、脂肪細胞分化および骨細胞分化過程において顕著にその発現レベルを変化させることから、fad104の発現調節機構の解明も極めて重大な命題である。本年度の検討によって明らかにされたいくつかの知見は、骨細胞分化過程におけるFAD104の作用機序の一端を明らかにしたものであり、概ね目標通りの進展であると考えられる。本年度得られた知見をベースに来年度以降も研究を進めることによって、骨分化過程におけるFAD104の役割と機能の全容解明につなげていきたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、本年度新たに得た知見について、より詳細な検討を続ける。具体的には、FAD104とSmad1/5/8との相互作用に重要と思われるFAD104のN端に存在するグリシンリッチ領域の役割を明らかにする必要がある。アミノ酸の置換などにより、相互作用に重要な領域を絞り込むとともに、その相互作用機構について明らかにしていく。また、FAD104がSmad1/5/8のどの領域と相互作用するのかについても明らかにする必要がある。Smad1/5/8の各種欠損変異体を作製し、相互作用部位を同定する。さらに、その相互作用によりどのような機構でリン酸化レベルを制御するのかについても併せて明らかにする。さらに、fad104のプロモーター領域の同定と発現制御機構の解明を進める。さらに、これらの検討に加え、fad104が骨関連疾患発症に与える影響についても検討を進める。
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| Causes of Carryover |
本年度の検討では、当初の予定よりもスムーズに検討を進めることができたため、ガラス器具類ならびにプラスチック器具類の支出を抑えることができた。そのため、翌年度に持ち越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
来年度以降の検討においては、今年度得られた結果について、さらに深く掘り下げた検討が必要になる。また、本年度の結果についてさらに進めるためには、新たに抗体およびキットの購入が必要であるため、当初の予定額に加え、次年度使用額をプラスし、検討を進めていく。
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