2014 Fiscal Year Research-status Report
多剤耐性緑膿菌のアミノ配糖体耐性阻害剤の作用機序に関する分子基盤研究
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26460080
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| Research Institution | Aichi Gakuin University |
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Principal Investigator |
森田 雄二 愛知学院大学, 薬学部, 准教授 (00454322)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 緑膿菌 / 多剤排出ポンプ / 遺伝子改変 / アミノ配糖体 / ベルベリン誘導体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
緑膿菌の主要なアミノ配糖体耐性系の１つであるresistance nodulation cell division（RND）型多剤排出系MexXYの発現プラスミドを構築した。構築したプラスミド上で基質特異性に関与する内膜の輸送体成分であるMexYからアミノ末端にヒスチジンヘキサマー（6個のヒスチジンからなるペプチド）を付加した融合タンパク質MexYhis6に改変した。その結果ウェスタンブロット法によりMexYの産生量を測定できるようになった。MexXYhis6の機能はMexXYと同様であることを緑膿菌形質転換株の各種抗菌薬に対する薬剤耐性能により確認した。こうして出来たプラスミドDNAに突然変異処理を施したものをmexXY遺伝子の欠損した緑膿菌変異株に導入した。ネガティブ選択によりアミノ配糖体耐性能の消失した変異株を約350株得た。そのうち他の抗菌薬耐性能を保持しているものを10株得た。アミノ配糖体の基質認識に関与するMexY変異体を構築できたかもしれない。
MexXY阻害剤としてスクリーニングされた天然物ベルベリンをシード化合物とし、ベルベリンの13位にベンジル基を導入した誘導体をデザインした。合成は、市販のベルベリン塩酸塩を水素化ホウ素ナトリウムによって還元することでジヒドロベルベリンへと誘導し、これを共通の出発原料とし各種ベンジルブロマイドと加熱還流することで、新規化合物4種類を含む10種の化合物を得た。得られた化合物のMexXY阻害活性を薬剤感受性試験により調べた。ベンジル基のオルト位に置換基を持つ化合物はより高い阻害活性を持つことが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
この研究の目的は緑膿菌の主要なアミノ配糖体耐性系の１つである多剤排出系MexXYの阻害剤開発に向けた分子基盤の確立である。アミノ配糖体耐性能の消失しているが他のいくつかの抗菌薬に対するMexY変異体候補がいくつか得られつつあること、及びMexXY阻害剤のリード化合物より活性の上昇した化合物が得られたことを考えると初年度としてはおおむね順調に進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
アミノ配糖体耐性能の消失しているが他のいくつかの抗菌薬に対するMexY変異体候補について構造決定、生化学的性状解析を行う。また引き続きMexY変異体候補を探索する。また化合物の構造と標的タンパク質MexYの構造に対する結合モデルを組むことで、よりMexXY阻害活性が高いと考えられる化合物のデザインを行う。具体的には主骨格の構造、他部位への置換基の導入、水素結合部位の数や位置の検討を行いより活性の高い化合物の合成を試みる。
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| Causes of Carryover |
実験計画より消耗品購入額が少なかったため。消耗品購入の時期が少し次年度に繰り越したに過ぎない。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
主に研究の消耗品購入、学会の参加費・旅費、論文投稿の必要経費に用いる。
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