シトクロムc-LRG複合体の構造とその生理機能の解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26460082
• Research Institution: Osaka University of Pharmaceutical Sciences
• Principal Investigator: 井上 晴嗣 大阪薬科大学, 薬学部, 准教授 (70183184)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 生体分子 / 蛋白質 / 生理活性

Outline of Annual Research Achievements

日本血液製剤機構から提供を受けたヒト献血血液画分(Eff.I画分)500mLから、Cyt cアフィニティーカラムとResourceQカラムを用いて約3mgのLRGを精製した。N-Glycosidase Fを用いて糖鎖を切断後、ウマCyt cを加えて複合体を形成させ、ResourceQカラムでCyt c-LRG複合体を精製した。現在、結晶化スクリーニングキットで複合体の結晶化条件を検討しつつある。また、浮遊型HEK293細胞を用いて組換えヒトLRGの大量生産を試み、培地60mLから組換え体を1mg得ることに成功した。
Cyt cをマウスに尾静脈投与したところ、Cyt cは血中のLRGと複合体を形成するとともに、肝臓におけるLRG生合成を促進することがわかった。また、Cyt c投与によって、野生型マウスでは血中G-CSF濃度が増加したが、LRGノックアウトマウスでは血中G-CSF濃度に変化は認められなかった。
また、Cyt c-LRG複合体の抗酸化作用をORAC法で検討した。その結果、Cyt c単独、LRG単独よりも、複合体の抗酸化作用が強いことが判明した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Cyt c-LRG複合体の作用が、複合体に対する受容体を介した作用なのか、複合体の抗酸化作用によるものなのか、まだはっきりしていない。直接的な作用が確認できていないので、マイクロアレイによる解析やTLRリガンドスクリーニングサービスもまだ実施していない。

Strategy for Future Research Activity

献血血液とほ乳類発現系を用いてLRGを大量精製するとともに、Cyt cとの複合体の結晶化条件を検討する。また、ほ乳類発現系を用いて変異型LRGを作製して、Cyt c結合に関与する部位を特定する。また、肝臓での複合体によるLRG生合成促進機構を検討するため、マウス肝臓からクッパー細胞を単離培養し、Cyt c-LRG複合体の作用を調べる。クッパー細胞での遺伝子発現をマイクロアレイを用いて調べる。また、マウスにCyt cを尾静脈投与してCyt c-LRG複合体を形成させた後、抗酸化活性に変化が見られるかどうか検討する。