2016 Fiscal Year Annual Research Report
development of genome-editing techniques using engineered nucleases
| Project/Area Number |
26460088
|
|---|
| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
|---|
Principal Investigator |
久野 悠 国立研究開発法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 基礎科学特別研究員 (60467636)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | ヌクレアーゼ / ゲノム編集 / TALEN / CRISPR/Cas9 / ゼブラフィッシュ / ノックイン / 逆遺伝学 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
マウスでは生殖細胞へと分化可能なES細胞が樹立されているため、相同組換えによりゲノムを編集した個体を作製でき、標的遺伝子を破壊した際の表現型を解析する逆遺伝学的解析が進められ、多くの遺伝子の生理機能がマウスを中心に解明されてきた。一方で世代時間や飼育コスト、ゲノムサイズ、観察の容易さなどから研究目的に適した様々なモデル生物が利用されているが、マウス以外のモデル生物ではES細胞が樹立されておらず逆遺伝学的解析が困難であった。このような状況下で近年、ゲノムの標的部位にDNA二本鎖切断を引き起こすTALENやCRISPR/Cas9システムが開発され大きく注目されている。
これらの人工ヌクレアーゼによってDNA二本鎖切断が引き起こされると、細胞が持つ二種類の修復機構が働く。１つは非相同末端結合修復と呼ばれるもので、切断末端が直接繋もう１つは相同組換え修復で、切断部位と相同配列を持つ鋳型を利用して修復するため外来遺伝子を挿入・置換することが可能である。CRISPR/Cas9システムではgRNAが標的配列の認識に関わり、Cas9ヌクレアーゼと複合体を形成することによりDNA二本鎖切断を引き起こす。効率の良い遺伝子挿入を行うため、gRNAの認識配列 を持つドナーベクターを作成した。相同配列を持たないプラスミドでは約50%の頻度で日相同末端結合により遺伝子挿入が生じていた。一方で、10bpから40bpの比較的短い相同配列を導入したプラスミドでは約80%と挿入頻度が上昇し、そのうち60-70%という高頻度で相同配列を利用した正確な遺伝子挿入が行われていることをDNAシークエンスにより確認した。さらにこの外来遺伝子の挿入が生殖細胞にも生じており、次世代に引き継がれることを確認した。次世代への継代効率はインジェクションした胚における挿入効率と大きく相関があることを明らかとした。
|
