2015 Fiscal Year Research-status Report
GPCRのアロステリックリガンド：細胞応答測定による親和性解析法とリガンド探索
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26460092
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
須賀 比奈子 順天堂大学, 医学部, 特任助教 (50261186)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | GPCR / リガンド / アロステリックリガンド / 薬理学 / 細胞応答 / リガンドバイアス / Gタンパク質共役受容体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
(A)細胞応答測定によるG蛋白質共役受容体(GPCR)のアロステリックリガンドの解析法：GPCRへのアロステリックリガンド結合に関する全ての媒介変数を推定する理論と解析法を開発することを試みている。この解析法を実証するために、M2ムスカリン性アセチルコリン受容体、または、恒常的に活性化させた変異M2受容体を培養細胞に発現させて、作動薬で刺激し、細胞応答を測定することにより、必要なデータを収集している。また、この解析法が様々な細胞内シグナル系に対する作動薬の選択性(リガンドバイアス)の定量に適用可能か調べるため、リガンドバイアスの定量に適した細胞応答測定法としてTGFα切断アッセイの確立を行っている。
意義：この解析法が開発されると、標識リガンドや比活性の高い標識リガンドが無い等の理由で、リガンド結合実験ができない場合でも、細胞応答測定のみで、アロステリックリガンドの親和性解析が可能になる。また、リガンドバイアスの定量が可能になる。
(B)パーキンソン病治療のリード化合物探索：パーキンソン病等治療のリードとしてM1受容体のアロステリックリガンドを探索することを計画していたが、メガファーマ等により先行研究されていることを知ったため、別の方法を用いることにした。即ち、パーキンソン病の原因遺伝子産物Parkin及びPINK1を共発現させた酵母細胞の増殖を阻害する化合物の探索を行った。化合物19200種のスクリーニングを行い、候補化合物を1種得た。この化合物のParkin単独発現細胞におけるlogEC50（50%効果濃度）は、Parkin/PINK1共発現細胞におけるlogEC50と比べて、約0.4高かった。このことから、この化合物はPINK1に作用すると思われた。現在、この化合物の作用機構を調べている。
意義：本研究は、パーキンソン病の治療法開発に役立つ。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成26年度にやや遅れたため。
現在、TGFα切断アッセイの確立を行なっているが、このことにより研究が大きく進展すると思われ、遅れが解消されると思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
(A)細胞応答測定によるGPCRのアロステリックリガンドの解析法：GPCRへのアロステリックリガンド結合に関する全ての媒介変数を推定する理論と解析法を開発する。この解析法を実証するために必要なデータを収集する。即ち、恒常的に活性化させた変異M2受容体または野生型M2受容体、及び、各種Gタンパク質を共発現させた培養細胞を、各種作動薬と各種アロステリックリガンドで刺激して、TGFα切断アッセイを行う。また、これらの受容体を、拮抗薬4-DAMP の窒素マスタード誘導体でアルキル化することにより、一部を不活性化させて、同様の実験を行う。同様の実験系で、他の細胞応答（細胞内Ca2+上昇、cAMP濃度減少、アレスチン動員（細胞内取り込みの指標）など）を測定し、作動薬とアロステリックリガンドの定数の値が、細胞応答測定法に関係無く、一定であることを実証する。次に、M1受容体、M3受容体、M5受容体を用いて、同様の実験を行い、この解析法が他の受容体にも適用可能であることを示す。
(B)パーキンソン病治療のリード化合物探索：得られたParkin/PINK1共発現細胞の増殖を阻害する化合物の作用機構及び結合部位を調べる。化合物の最適化を行い、更に活性の高い化合物を合成する。PINK1を発現させた哺乳動物細胞を用いて、化合物の作用を調べる。化合物を結合したPINK1の分子モデルを、計算科学を用いて作製する。
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| Causes of Carryover |
平成26年度に次年度使用額が生じたから。研究代表者が，東京大学→京都産業大学→順天堂大学と異動したので、異動の前後は会計処理の都合上、科研費の使用を控えたから。東京大学および京都産業大学では、一部の試薬やプラスチック器具などは、研究室の買い置きを使うことができたから。順天堂大学着任時には既に授業や会議の日程が決まっていて、当初参加を予定していた海外の学会の日程と重なっていたため、海外の学会に参加することができなかったから。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
順天堂大学では、研究に必要な全ての物品を科研費から購入しなくてはならない。分子生物学実験、生化学実験、細胞培養、各種アッセイ、RI実験などに使用する試薬やプラスチック器具、キムワイプなどを1から全て揃える必要があり、当初の予定よりかなり多額を使用する計画である。また、順天堂大学では、クリーンベンチや共通機器の使用料を払わなくてはならない。このような当初は予定していなかった費用に使用する計画である。これらに、次年度使用額の約80%を使用する。
カリフォルニア大学アーバイン校の研究協力者を訪問し、研究（解析法、計画など）、及び、論文執筆について打ち合わせを行うための旅費に使用する計画である。
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