2015 Fiscal Year Research-status Report
カルボキシル基形成に関与する多機能型チトクロームP450酵素の機能解明とその応用
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26460132
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
安齊 洋次郎 東邦大学, 薬学部, 教授 (20318299)
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2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 抗生物質 / P450酵素 / 応用微生物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
放線菌Micromonospora rosaria IFO13697が生産する16員環マクロライド抗生物質rosamicinの生合成に関与する多機能型チトクロームP450酵素であるRosCタンパク質を大量発現した大腸菌による生物変換によりrosamicinの20位がカルボキシル基に変換され、その結果として20-carboxyrosamicinに変換されたことを最終的に確認をするため、変換物質の構造をNMRで解析したが、精製された変換物質の量が十分ではなかったため、構造の確定には至っていない。
ポリエン系抗真菌薬amphotericinのカルボキシル基形成機構に関与すると考えられているチトクロームP450酵素AmphNの機能解析のため、amphN遺伝子欠損株の作成を試みた。amphN遺伝子の上流域と下流域の領域をPCRで増幅したDNA断片でネオマイシン耐性遺伝子neoを挟み込んだものをS. nodosus NBRC 12895に導入して得られたネオマイシン耐性株のうち数株ではamphotericin生産能が失われていた。現在、これら菌株の遺伝学的な確認を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
RosCタンパク質によりrosamicinからに変換されたと考えられる20-carboxyrosamicinの構造確認のためには、大量の変換物質が必要となる。その効率的な生物変換は確立出来たが、その変換物の精製に手間取り、また、NMR解析に必要な精製物質が予想以上に必要であったため、構造の確定には至っていない。また、amphN遺伝子欠損株については、その欠損領域周辺にて、予想外の組換えが起こっていることが予備実験より推定されており、その確認に時間を要している。以上のことより、平成27年度の実験計画が少々遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
RosCタンパク質によりrosamicinからに変換されたと考えられる20-carboxyrosamicinの構造確認は今年度前半には終了すると思われる。今後はRosCの多段階酸化反応に関与するアミノ酸残基の同定を進め、その結果から、rosC変異遺伝子による抗生物質生産を行う。また、amphN遺伝子欠損株の遺伝学的確認の結果によっては、再度、amphN遺伝子欠損株を試み、その欠損株からのamphotericin生合成中間体を取得する。そして、その生合成中間体を用いたAmphNを大量発現させた大腸菌による生物変換実験系を確立するとともに、カルボキシル基形成に関与するAmphNのアミノ酸残基を同定する。
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| Causes of Carryover |
RosCの変異導入実験ならびにAmphNを大量発現させた大腸菌による生合成中間体変換試験まで研究を進めることが出来なかったため次年度使用額が発生した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成28年度は平成27年度と同様な支出が予想されるため、平成28年度は次年度使用額は生じないと予想される。
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