2017 Fiscal Year Annual Research Report

Functional analysis and its application of multifunctional cytochrome P450 enzymes forming carboxyl group

Research Project

Project/Area Number	26460132
Research Institution	Toho University
Principal Investigator	安齊洋次郎東邦大学, 薬学部, 教授 (20318299)
Project Period (FY)	2014-04-01 – 2018-03-31
Keywords	抗生物質 / P450酵素 / 酸化反応
Outline of Annual Research Achievements	放線菌Micromonospora rosaria IFO13697が生産する16員環マクロライド抗生物質rosamicinの生合成に関与するP450酵素RosCを大量発現した大腸菌による生物変換によりrosamicinの20位がカルボキシル基に変換され20-carboxyrosamicinとなることが確認され、このP450酵素RosCが3段階の酸化反応（rosamicin 20位の酸化、アルコール酸化、酸化）に関与することを明らかにした。また、放線菌Streptomyces fradiaeが生産する16員環マクロライド抗生物質Tylosinの生合成に関与し、RosCとアミノ酸配列の相同性が高いP450酵素TylIもRosCと同じくrosamicinの20位カルボキシル化を行うことを明らかにした。 RosCの3段階の酸化反応に関与するアミノ酸残基の同定のためにランダム突然変異を行った。3段階の酸化反応を触媒する活性を有するものの、変換効率が低下するアミノ酸変異が生じたクローンとしてRM21、1段階目の水酸化の触媒能を保持しつつ、2段階目以降の酸化反応の触媒能を欠失するアミノ酸変異が生じたと考えられるクローンとしてRM30を取得した。これらクローンは5カ所の塩基で変異が確認されており、RM30で確認された変異から生じるアミノ酸残基の変異L176Qは基質認識や基質結合時の構造変化に関連しているとされるFGループ領域で変異が生じていることがSwiss modelにより予測したRosCの立体構造から推定された。今後、更なる変異クローンの取得とその変異の解析を行うことにより、多機能型P450の複数回の酸化反応を自由に制御することが可能となり、新たな抗生物質のデザインや生産法の開発に新たな展開を生み出すことが出来ると考える。