2014 Fiscal Year Research-status Report
蛍光性顔料色素を用いた局所染色可能な分子プローブの開発と応用に関する研究
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26460166
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| Research Institution | Hiroshima International University |
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Principal Investigator |
大坪 忠宗 広島国際大学, 薬学部, 准教授 (30365879)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | シアリダーゼ / 蛍光基質 / 組織染色 / グルコシダーゼ / インフルエンザ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究計画に沿って、固体蛍光性である2-ベンゾチアゾリルフェノール（ＢＴＰｓ）を組み込んだβ－グルコース誘導体およびシアル酸誘導体を合成した。
グルコース誘導体は、ＢＴＰｓのフェノール環に導入した置換基の位置と、ベンゾチアゾール環上の置換基の有無によって、酵素選択性を有するという知見を得た。予備的な検討を行ったところ、由来の異なるグルコシダーゼに対する選択性（基質としての適合性）は、数１００倍程度であった。また同じ酵素であっても、合成したβ－グルコース誘導体に対する加水分解活性は大きく異なり、組み合わせによっては１０００倍程度の差が観測された。
シアル酸誘導体は、我々が開発した既存のシアリダーゼ基質がプラークアッセイや組織サンプルの蛍光染色には十分であるが、細胞内のシアリダーゼ活性分布を観察するには不十分であったため、蛍光解像度の向上を目的として研究を行った。臭素原子を持つBTPをアグリコンとする基質前駆体に対して、遷移金属触媒を用いて錨となる官能基を組み込んだ誘導体を効率よく合成した。導入した官能基と解像度の関係を定性的に調べたところ、従来型の基質では不可能であった細胞内部における局所的なシアリダーゼ活性を検出することが可能であると示唆された。インフルエンザウイルス感染細胞において、特にシアリダーゼ活性が強く観測されたのは、細胞膜、ゴルジ（と推測される細胞内小器官）であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度計画であった２－ベンゾチアゾリルフェノール（ＢＴＰｓ）を組み込んだβ－グルコース誘導体およびシアル酸誘導体を合成した。
グルコース誘導体は、酵素反応性に関する相対的な指標として用いうることを明らかとした。シアル酸誘導体は、既存のシアリダーゼ基質がプラークアッセイや組織サンプルの蛍光染色には十分であるが、細胞内のシアリダーゼ活性分布を観察するには不十分であったた点を改善し、細胞内シアリダーゼ活性が細胞膜、ゴルジ（と推測される細胞内小器官）に特に強く観測されることを明らかとした。この新しく開発した蛍光シアリダーゼ基質を基として、特許出願を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
β－グルコシダーゼの一般的な蛍光基質となりうる新規基質の設計・合成を行う。
昨年度期間中に合成したβ－グルコシダーゼ基質は、酵素選択性があり、酵素特性を指標化することによってある種の指紋を取得することが可能であった。しかし選択性は、別の見方をすれば基質として一般性が低くβ－グルコシダーゼ活性測定の基準になりえない。これを踏まえて、合成済み選択的基質の構造を改変し、蛍光色素を酵素の活性中心、即ちアノマー位から遠ざけた誘導体を合成する。さらに、合成した誘導体がβ－グルコシダーゼによって加水分解され、その蛍光強度が酵素量依存的に上昇するか検討を行う。
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| Causes of Carryover |
新規基質の合成において、複雑なシアル酸骨格を持つにも関わらず一般的な条件で目的物を得る事が出来て高価なリガンドやパラジウム触媒を必要としなかったことと、類似化合物に選択と集中を行ったため分離に掛かるコストを抑制できたことによるものである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
既存の機器（減圧濃縮機、凍結乾燥器、冷却水循環装置など）を用いて研究を遂行してきたが、特に冷却水循環装置、ケミカルポンプは老朽化が進み、研究遂行に支障が出始めている。昨年度のコスト削減による計画的に確保した次年度使用額を、これら一部機器の購入に充てる予定である。
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