2015 Fiscal Year Research-status Report
ヒト細胞を用いた医療用タンパク質高生産システムの開発
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26460167
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| Research Institution | Kitakyushu National College of Technology |
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Principal Investigator |
井上 祐一 北九州工業高等専門学校, 生産デザイン工学科, 准教授 (20284911)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川原 浩治 北九州工業高等専門学校, 生産デザイン工学科, 教授 (20321515)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ヒト細胞株 / 医療用タンパク質 / GMP |
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| Outline of Annual Research Achievements |
・新規GMP対応ヒト細胞株の樹立とマスターセルバンクの作製
医薬品製造管理及び品質管理基準(Good Manufacturing Practice: GMP)環境下では使用できる試薬などが制限されるため、まず平成26年度に確立した非GMPでの細胞株樹立条件をGMP用に改良し、改良した条件でも非GMPでクローンを取得できることを確認した。引き続き同じ条件で、GMP環境下でフィコール密度勾配遠心法によりヒト末梢血リンパ球を分離し、クローンの取得を試みた。しかし、GMPでは非GMPのようにクローンを取得することはできなかった。この結果の主な原因としては、GMPでは除染工程や不自由なグローブ操作があるため、ヒト末梢血リンパ球の分離に時間を要し、細胞の回収率や生存率も低下したことがあげられる。
・細胞のタンパク質発現活性化および培養最適化
非GMP環境下で取得したヒトBリンパ球系クローンにIFN-beta発現ベクターを導入し、IFN-betaタンパク質の発現量について調べた結果、その発現量は同様に行ったチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株の約200分の1であることが分かった。今回はCMVプロモーター制御系発現ベクターを使用したが、新たにクローニングしたBリンパ球特異的プロモーター（MYEOV2）制御発現ベクターを使用しても同様にヒトBリンパ球系クローンではIFN-betaの発現量は低かった。また、これらのヒトBリンパ球系クローンについては、現在、並行して無血清培養条件も検討し、培養最適化を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
非GMP環境下では成功したクローンの樹立がGMP環境下では成功しておらず、新規ヒト細胞株のマスターセルバンクの作製に至っていないため。また、新たにクローニングしたBリンパ球特異的プロモーター（MYEOV2）制御発現ベクターを使用しても非GMP環境下で樹立したクローンではIFN-betaの発現量が低かったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
・新規GMP対応ヒト細胞株の樹立とマスターセルバンクの作製
除染工程は変更できないため、それ以外の手順を見直して時間を短縮する。グローブ操作を習熟化し、リンパ球の回収率や生存率を上げる。GMP環境下で長期間培養可能なクローンを取得し、マスターセルバンクを作製する。
・細胞のタンパク質発現活性化および培養最適化
MYEOV2プロモーターを活性化する物質を探す。Bリンパ球に最適な別のプロモーターをクローニングし、樹立した細胞のタンパク質発現量を向上できるようにする。IFN-beta以外のタンパク質発現についても調べる。引き続き、細胞の無血清培養や高密度培養などの培養条件を調べ、最適化する。
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| Causes of Carryover |
物品費や旅費で少額の残金が生じたが、合わせても必要な物品を購入するには不足していたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
翌年度分の助成金と合わせて必要な物品を購入する。
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