2014 Fiscal Year Research-status Report
アクアポリンが関与する尿崩症機序解明とアクアポリンの機能制御化合物の探索
| Project/Area Number |
26460223
|
|---|
| Research Institution | Gifu Pharmaceutical University |
|---|
Principal Investigator |
臼井 茂之 岐阜薬科大学, 薬学部, 准教授 (40176665)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大山 雅義 岐阜薬科大学, 薬学部, 教授 (30381718)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | アクアポリン / 細胞膜移行 / 細胞質移行 / プロテインキナーゼC / Akt / 緑色蛍光タンパク質 / アクチン / 微小管 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
平成26年度は、AQP3の細胞膜移行機序の解明と膜移行を促進または抑制する物質の探索を行った。AQP3の細胞内局在性を検出するため、GFP発現プラスミドにAQP3cDNAを組み込み、これをヒト表皮由来HKA-1細胞内へトランスフェクトしてGFP-AQP3融合タンパク質を発現させ、GFPに由来する緑色蛍光を共焦点レーザー顕微鏡にて観察する手法を用いた。著者らはこの方法を用いて、HKA-1細胞中のGFP-AQP3がHepG2細胞中のnative AQP3と同様に、PKC活性化剤であるホルボールエステル(PMA)により細胞膜移行することを確認した。また、PKCの阻害剤Calphostin Cの存在下、更に、Rho阻害剤Rho inhibitor 1やアクチン重合阻害剤cytochalasin Dの存在下では、PMAによるGFP-AQP3の膜移行は観察されなかった。
AQP2の膜移行には、Ser残基のリン酸化が必要であることが報告されており、且つ、PKCがセリン・スレオニンキナーゼであることから、AQP3についても膜移行とリン酸化の関連性を検討した。AQP3のPKCによるリン酸化の候補部位のうち、Thr237とSer275を部位特異的変異法によりそれぞれAlaに変異したところ、PMAによるGFP-AQP3の膜移行は観察されなかった。しかし、他のリン酸化候補部位であるThr52とThr107を変異させたT57AとT107Aでは、PMAによるGFP-AQP3の膜移行が認められた。
AQP3 の細胞膜移行に影響を及ぼす天然由来化合物について、水分代謝に影響を及ぼす生薬エキスを中心に探索を行った。その結果、ジオウ及びシンイから調製した90％エタノール抽出エキスが、GFP-AQP3の膜移行を促進することが認められた。
以上、得られた知見は、皮膚の水分調節機構の解明に役立つものと考えられる。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的は、AQP3の細胞基底膜への局在化機序の解明と、その局在化を制御する天然物由来化合物の探索を行うことである。初年度である平成26年度では、「研究実績の概要」に記載した通り、AQP3はPKCによって膜移行(細胞膜への局在化)が調節されていること、更に、この膜移行には、Rhoおよびアクチンが関与すること、また、AQP3のThr237とSer275のリン酸化によって膜移行が惹起されることを明らかにした。一方、AQP3 の細胞膜移行に影響を及ぼす天然由来化合物について、促進物質を2種類見出した。これらの成果は、交付申請書に記載した平成26年度の研究実施計画通りに進行して得られたものであり、本研究は順調に進展していると考える。
|
| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度では、細胞質以上機序の解明と細胞質移行を促進または抑制する化合物の探索並びにその作用機所の解明を実施する予定である。先に述べたように、AQP3の膜移行はPKCの活性化により引き起こされるが、GLUT4では、インスリンにより膜移行が惹起されることが報告されている。そこで、AQP3の細胞内局在性に及ぼすインスリンの影響を検討したところ、インスリンがGFP-AQP3の細胞質移行を促進することを見出した（未発表データ）。AQP類の細胞質への移行については、これまでに全く報告されておらず、細胞膜から細胞質への移行は、無制御に起こると考えられてきた。しかし、インスリンによって細胞質移行が促進されることから、インスリンのシグナル伝達経路が関わる可能性が考えられるため、先ず、経路中のシグナル伝達因子PI3K、PDK、Aktの細胞質移行への関与について、これらの阻害剤を用いて検討する。
AQP2は、細胞質内で微小管に付着したAQP2-strage compartmentに格納されていることが報告されている。従って、AQP3の細胞質移行と微小管形成との関連性を検討すると共に、このcompartment形成に関わるAS160やTBC1D1等のタンパク質のリン酸化状態を抗リン酸化抗体を用いて検討する。
AQP3 の細胞膜移行並びに細胞質移行に影響を及ぼす天然由来化合物の探索を、昨年度と同様に引き続いて行う。特に、申請時に研究分担者と協議しているxthntone類、fravonoid類、stilbene類などの化合物について、AQP2とAQP3の細胞質・細胞膜間移行に影響を及ぼすかどうかを検討する。
|
