2015 Fiscal Year Research-status Report
アクアポリンが関与する尿崩症機序解明とアクアポリンの機能制御化合物の探索
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26460223
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| Research Institution | Gifu Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
臼井 茂之 岐阜薬科大学, 薬学部, 准教授 (40176665)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大山 雅義 岐阜薬科大学, 薬学部, 教授 (30381718)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | アクアポリン / 細胞膜移行 / 細胞質移行 / プロテインキナーゼＣ / Ａｋｔ / アクチン / 微小管 / 緑色蛍光タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成27年度は、AQP3の細胞膜移行を促進する天然由来物質の探索とAQP3の細胞膜移行機序の解明を主として研究を行った。なお、AQP3膜移行の測定は、前年度に開発した方法、即ち、HKA-1細胞中でGFP-AQP3融合タンパク質を発現させ、GFPに由来する緑色蛍光を共焦点レーザー顕微鏡にて観察する手法を用いた。
平成26年度の実施状況報告書に記載したように、生薬であるジオウ及びシンイから得られた90％エタノールエキスがAQP3の細胞膜移行を促進することを見出したので、エキス中に含まれる何れの成分が膜移行を誘引するかを探索した。ジオウ及びシンイの主成分である夫々β‐シトステロールとo‐オイゲノールを用いてAQP3の細胞膜移行を観察した結果、β‐シトステロールでは膜移行が認められなかったが、1mM o‐オイゲノールによって膜移行が促進することを見出した。このo‐オイゲノールによる膜移行促進の機序を検討したところ、PKCのリン酸化を介し、更に、その下流のROCKを経たアクチン重合が関与することが示唆された。
通常の培養状態ではAQP3は細胞膜と細胞質の両方に存在し、PKCのリン酸化を介して細胞膜移行することは、上述したが、この細胞膜に移行したAQP3がどのような機序で細胞質に戻るのかは不明であった。そこで、細胞質移行の機序を解明する目的で、主なシグナル伝達経路の活性化剤を用いで検討したが、元々通常培養状態でAQP3が細胞質に存在することから、細胞膜から細胞質への移行は、共焦点レーザー顕微鏡ではほとんど観察できなかった。しかし、PKC活性化剤を用いて、予め、AQP3を細胞膜に移行させたのち、細胞質への移行を観察した結果、インスリンによって細胞質移行が促進されること、更に、Akt阻害剤を併用すると、細胞質移行が抑制されたことから、Aktの活性化が関与することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度に、生薬ジオウとシンイのエキスによってAQP3の細胞膜移行が促進することを認めたので、本年度は、エキス中の成分探索を行った。その結果、シンイに含まれるo‐オイゲノールが、AQP3の細胞膜移行を惹起することを見出した。更に、その作用機序を検討した結果、o‐オイゲノールによってPKCが活性化され、続いて、その下流のROCKの活性化を経て、アクチン重合が関与することを認めた。このAQP3の細胞膜移行を促進する天然由来物質の発見の成果は、当初の研究計画に記述した通りに進行している。一方、ジオウ中の膜移行促進物質の探査については、ジオウの主成分であるβ‐シトステロールを用いて探求したが、AQP3の細胞膜移行は観察されなかった。引き続き、成分探索を行う予定である。
本年度のもう一つの研究テーマであるAQP3の細胞質移行について、インスリンが移行を促進することを見出した。インスリンのシグナル伝達経路の阻害剤を用いて検討した結果、細胞質移行は、PI3K及びAktの活性化を介して生じることが示唆された。更に、この細胞質移行は、微小管の脱重合阻害剤デメコルシンにより抑制されたが、アクチン重合阻害剤の影響は受けなかった。このことより、細胞質移行と細胞膜移行とは異なる機構が介在している可能性が考えられた。
以上の結果は、当初の研究計画にほぼ沿って進展しているが、細胞質移行機序の更なる詳細が期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度では、AQP3の移行機序の解明及びAQP3の移行を促進または抑制する天然由来物質の探索を引き続いて行う予定である。
AQP3の移行機序の解明 AQP2の細胞膜移行では、アデニル酸シクラーゼの活性化によるcAMP濃度の上昇を介してPKAが活性化され、アクチン重合を伴うことが報告されており、AQP3の細胞膜移行とは、アクチン重合が関与して膜移行する点で共通である。更に、膜移行にはAQP2のリン酸化が必須であり、AQP3の細胞膜移行にもリン酸化が関与することを認めている。そこで、リン酸化されたAQPがどのような機構で膜移行するかを明らかにするため、先ず、AQP3とタンパク質小胞輸送との関連のあるsnapin、syntaxin、Rab類等のタンパク質とのタンパク質間相互作用を解明する予定である。一方、AQP3の細胞質移行については、Aktと微小管の関与が示唆されたが、GLUT4ではAktの活性化により細胞膜移行することが報告されており、AQP3とGLUT4とでは真逆の移行をすることが明らかとなった。GLUT4の細胞膜移行には、TC10、Rac1、AS160、TBC1D1等のシグナル伝達因子が関与することが報告されているので、AQP3においてもこれら因子との関わりを検討する予定である。
AQP3の移行を促進または抑制する天然由来物質の探索 ジオウの抽出エキスはAQP3の細胞膜移行を促進したが、主要成分であるβ‐シトステロールは移行に何ら影響を及ぼさなかった。従って、ジオウ中の他の成分について、移行に影響を及ぼす物質の探索を行う。また、シンイ中のo‐オイゲノールはポリフェノールの1種であるので、AQP3の移行に及ぼす他のポリフェノール類、例えばレスベラトロール等の影響を検討する予定である。
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