2014 Fiscal Year Research-status Report
細胞運動/増殖の制御による軸骨格の部域特異的形態形成：胚操作および培養実験系
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26460254
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
青山 裕彦 広島大学, 医歯薬保健学研究院, 教授 (70143948)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 肋骨 / 体節 / 側板中胚葉 / 部域化 / 形態形成 / 細胞接触 / 接触阻害 / in vitro |
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| Outline of Annual Research Achievements |
鳥類やほ乳類では，胸部で形成される肋骨が，他の部域では形成されない．この特異性は，肋骨原基である体節の発生能の違いとともに，その周囲組織による抑制/助長作用もある．この両者が相まって安定した形態形成がなされるのであろう．
ニワトリ胚で胸部体節を腰部に移植すると，肋骨は形成されるものの正常のものと比較して短い．このキメラ胚では，胸部体節細胞は腰部側板中胚葉に進入できないことから，我々は，体節細胞の移動が側板中胚葉によって抑制された結果，形成される肋骨が短くなると考えた．本研究では，細胞間相互作用を再現するin vitro 系を確立し，体節細胞移動抑制の機構を細胞運動のレベル，さらには分子レベルで解明する．
１．肋骨を形成する胸部体節細胞と腰部側板中胚葉細胞間の相互作用をin vitroで再現する：サイトグラフ（大日本印刷）を用いて体節と側板中胚葉の共培養実験を行い，細胞が一次元の基質上で出会うようにした．胸部体節細胞が胸部側板細胞と出会うとそのまま前進を続けようとし糸状突起を基質の隙間へ伸ばすが，側板細胞を押しのけることができないので細胞の移動は停止した．一方，腰部側板細胞とであうと，体節細胞はそれまでの進行方向と反対方向に移動した．
２．肋骨形成能を持った胸部体節細胞の移動を抑制する因子の探索：今年度はephrin とその受容体である Eph遺伝子の発現パターンを，ニワトリ胚の各発生段階について，ホールマウントin situハイブリダイゼーションにより調べた．ephrinとEphは，ニューロンの軸索ガイダンスや体節形成，血管形成などで働く反発性の因子であり，側板中胚葉と体節との間の相互作用に関与していることを期待した．4～7日胚について，EPHA1, A3, A4, A5, A6, A7, B1, B2, B3, B6, ephrinA2, A5, A6, B1, B2の発現パターンを調べたが，部域特異的な発現は見られなかった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．肋骨を形成する胸部体節細胞と腰部側板中胚葉細胞間の相互作用をin vitroで再現する：体節と側板中胚葉の共培養を，はじめ，二次元の基質上で行ったところ，接触阻害とみられる現象が現れたものの，その定量的解析が難しかった．そこでサイトグラフ（大日本印刷）を用いた一次元培養を試みたところ，接触阻害現象がやはり認められ，さらに運動が前後方向のみに限られるため定量的解析も容易になった．これまで胸部体節と胸部側板，腰部側板の共培養実験を行ったが，その他の部域の体節-側板中胚葉の共培養実験も行い，肋骨形成との関連を明らかにしたい．以上，この項目についてはほぼ順調に進んでいる．
２．肋骨形成能を持った胸部体節細胞の移動を抑制する因子の探索：今年度はephrin とその受容体である Eph遺伝子の発現パターンを，ニワトリ胚の各発生段階について，ホールマウントin situハイブリダイゼーションにより調べたが，部域特異的な発現は見られなかった．ネガティブデータではあるが，一定の結論を得たと言える．ただし，ホールマウント標本では詳細な内部構造まで観察できないため薄切標本を作り，より詳細な観察が必要と考えている．
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| Strategy for Future Research Activity |
まず，2014年度確立したin vitro実験系を用いて，共培養実験の組み合わせをさらに増やし，その結果が，胚の各部域ごとの正常発生，およびキメラ実験を説明出来るか，すなわち，このin vitro実験系が生体の現象を再現していることを十分確認する．
その後，この実験系を用いて，細胞間のシグナル伝達系を明らかにしたい．これは当初の研究計画にはEPH-ephrin系を具体例として挙げていたものであるが，逆に細胞の挙動からそれに関わるであろうシグナル伝達系を追求しようとするものである．例えば，胸部体節細胞が腰部側板中胚葉細胞と接触すると移動の向きが変わるが，これには細胞内骨格が関わっているものと予想される．これを証明するために，細胞内骨格の構成に影響を与える，細胞表面の受容体から細胞内シグナル伝達系の阻害実験を計画する．
一方，細胞間の反発因子とされるものも探究を続ける．EPH-ephrin系については薄切標本を用いたさらに詳細な観察が必要である．
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| Causes of Carryover |
2014年度，体節と側板中胚葉の共培養実験を行ったが，その観察のために顕微鏡に細胞培養装置および写真撮影装置を設置した．実際に実験を始めてみると，この装置が１セットでは作業効率が悪いのみならず，対照実験が実施しにくいことが分かり，次年度と合わせて機器の購入を計ることとした．そのため，2014年度途中からは，消耗品を基盤研究費から支出して，残りを2015年度に回すようにした．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
2014年度よりの繰越金56万円と2015年度直接経費130万円を合わせて下記の通り支出を予定している．
顕微鏡培養システム 1式 143万円，ニワトリ種卵 他 消耗品 53万円，計 186万円．
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