2015 Fiscal Year Research-status Report
脂質代謝異常の分子メカニズム-脂質メディエーター制御因子の形態学的解析-
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26460265
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| Research Institution | Yamagata University |
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Principal Investigator |
中野 知之 山形大学, 医学部, 助教 (00333948)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 脂質代謝 / 肥満 / 脂肪細胞 / ジアシルグリセロールキナーゼ / インスリンシグナル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ジアシルグリセロール (DG)は中性脂質合成の中間産物である。同分子は細胞内情報伝達系でセカンドメッセンジャーとして機能することもまたよく知られている。本研究では、平成26年度の実験により、DGのリン酸化酵素であるDG キナーゼ (DGK)アイソザイムのうち、epsilon型遺伝子欠損(DGKe-KO)マウスを高脂肪食で給餌すると、早期（40日）で肥満および白色脂肪組織におけるインスリンシグナリングに異常が生じることを明らかにした。研究2年目である平成27年度は、さらなる動物実験から前年度明らかにした高脂肪食給餌のDGKe-KOマウスに認められる表現型を精査した。その結果、前年度に得られた結果を支持する以下の2つの現象を見出し、国内の学会で発表した。①高脂肪食給餌のDGKe-KOマウスの精巣上体周囲白色脂肪組織においては炎症応答が生じている、②白色脂肪組織以外のインスリン作動性臓器（骨格筋および肝臓）ではインスリンのシグナルに異常は認められない。すなわち、DGKe-KOマウスでは高脂肪食給餌によって白色脂肪組織で炎症応答が生じ、同組織特異的にインスリンシグナルの異常が生じる。その結果、個体レベルでインスリン抵抗性が惹起される可能性が考えられた。さらに、動物実験で明らかとなった脂質代謝異常の直接的な原因を精査することを目的として、細胞培養の実験系の構築を試みた。3T3L1細胞やマウスから単離した脂肪前駆細胞を用い、脂質添加やサイトカイン刺激実験の条件検討（siRNAトランスフェクションのタイミング、細胞単離法およびオレイン酸添加）を行い、次年度の研究計画遂行に備えた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度の実験計画は、高脂肪給餌のDGKe-KOマウスにおいて①炎症応答が惹起される可能性の検討と②白色脂肪組織以外の組織におけるインスリンシグナルを検討することであった。①の肥満を示すDGKe-KOマウスにおける炎症応答の検討に関して、当初はサイクロオキシゲナーゼ-2や誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）の発現をウェスタンブロットで解析する予定であった。しかし、結果を得ることが困難であったため、これを組織学的解析によって補った。具体的には、精巣上体周囲白色脂肪組織をHE染色し、王冠様構造(CLS)の数を比較すると、DGKe-KOマウスにおいてCLS数が大幅に増加していることが明らかとなった。この構造を免疫組織化学的に解析した結果、iNOS抗体に対して免疫陽性反応が検出された。これらの結果からDGKe-KOマウスの白色脂肪組織では炎症応答が亢進していることが示唆された。②に関して、プロテインキナーゼCやAkt抗体を用いたウェスタンブロット解析により、高脂肪給餌のDGKe-KOマウスの肝臓および骨格筋では、インスリンシグナルの異常は検出されなかった。さらに、平成27年度の実験計画の記載したマウス脂肪前駆細胞(3T3L1細胞)およびマウスから単離した脂肪細胞の実験系をセットアップし、平成28年度の実験計画施行へ万端の準備を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
計画通り、最終年度においては、平成27年度の予備実験で確立した方法論および培養条件で以下の述べるin vitro実験系による“高脂肪負荷モデル”の再現を行う。①マウス脂肪前駆細胞株（3T3L1細胞）を定法に則り分化誘導し、siRNA法によってDGKeをノックダウンする。この細胞に対し、オレイン酸添加（＝高脂肪状態の再現）やサイトカイン刺激（インスリン抵抗性の再現）を行う。②野生型およびDGKe-KOマウスの精巣上体周囲白色脂肪組織から脂肪前駆細胞を単離し、分化を誘導した後、①と同様の条件で培養する。これらの実験から、野生型（コントロール）とDGKe遺伝子欠損細胞の間に認められるインスリンシグナルおよび脂質分解関連分子のタンパク発現レベルや細胞内局在における差異を解析し、DGKe欠損状態で生じる脂質代謝異常の詳細なメカニズムを解析する予定である。得られた結果は日本解剖学会および米国細胞生物学会で発表し、論文にまとめ、国際誌に投稿する予定である。
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