2014 Fiscal Year Research-status Report
インフラマソーム構成分子ASCによるがん細胞の転移制御機構の解明
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26460272
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
藤井 千文 信州大学, 学術研究院医学系, 助教 (10361982)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 浸潤突起 / インフラマソーム / 細胞骨格 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
がんは本邦で死因の第１位である。がん細胞の持つ浸潤能や転移能が最も大きな要因であるが、その制御は未だ非常に困難である。本研究代表者らは、これまでに種々のがんにおいて、炎症関連アダプタータンパク質ASCの発現量が、がんの悪性度と相関して低下することを報告した。しかしながら、ASCとがんの悪性化を結びつける分子メカニズムには不明な点が多く、さらなる解析が必要である。本研究課題では、ASCの発現抑制に伴うがん細胞の機能や形態の変化を基に、ASCによる細胞骨格制御を介した転移や悪性化の分子機構について解析し、新規転移がん治療法の開発へと繋げる基礎的知見を得ることを目的として解析を行った。
ASCの発現量低下ががん細胞に及ぼす影響を解析するため、ASCを発現しているマウスメラノーマ細胞株でshRNAを用いてASCノックダウン細胞を作製した。この細胞を用いて実験的肺転移モデルによる転移能の解析を行ったところ、ASCノックダウン細胞では転移巣の増加が認められた。細胞レベルでの解析により、ASCノックダウン細胞では、アクチン骨格の構造変化が見られ、細胞運動能および浸潤突起形成能の亢進が観察された。また、Srcファミリーキナーゼのリン酸化の亢進が認められ、細胞運動能評価の実験系および浸潤突起形成の実験系にSrc阻害剤を添加することにより、これらの反応が抑制された。このマウスメラノーマ細胞株では、浸潤突起に局在することが知られている細胞骨格制御因子とASCとの共局在が観察され、ASCのノックダウンにより、この分子の浸潤突起への局在の増加が見られた。以上の結果から、ASCの発現量低下により、細胞骨格のリモデリングが起こりやすくなり、細胞運動能や浸潤突起形成能が亢進することにより、転移能が高くなったものと考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、ASCの発現量低下ががん細胞に及ぼす影響を解析するため、ASCノックダウン細胞を作製し、解析を行った。上述のように、ASCのノックダウンにより、細胞運動能、浸潤突起形成能の亢進が認められ、実験的肺転移モデルでの転移能が亢進しているという結果が得られた。さらに、細胞内でのシグナル伝達について解析を行ったところ、Srcファミリーキナーゼ、Erkのリン酸化の亢進が認められた。また、細胞運動や、浸潤突起形成能は、Src阻害剤ダサチニブにより、有意に抑制されるという結果が得られた。以上の結果から、ASCノックダウン細胞において、何らかの機構でSrcの活性化が起こり、細胞運動能や浸潤突起形成能の亢進に繋がっているものと考えられた。
さらに、ASCノックダウン細胞では、アクチン骨格の変化が認められたことから、がん細胞の転移や運動に関与する種々の細胞骨格制御因子とASCとの結合を、免疫沈降法により解析した。現在までに約１０種類の分子との結合について、マウスメラノーマ細胞株での内在性のタンパク質を用いた解析および２９３Ｔ細胞での過剰発現系を用いた解析を行ったが、現在までに陽性の結果は得られていない。しかしながら、このうち、浸潤突起に局在することが知られている細胞骨格制御因子とASCとの局在を共焦点顕微鏡での観察により解析したところ、これらの分子の共局在が観察された。さらに、ASCのノックダウンにより、この分子の浸潤突起への局在の増加が見られた。以上の結果から、ASCの発現量低下により、細胞骨格のリモデリングが起こりやすくなっていることが考えられた。さらに、この分子は、Erkの足場タンパク質としても知られていることから、ASCのノックダウンにより、Erkのリン酸化が亢進したという結果とも矛盾しないものと考えられる。
以上の結果を得たことより、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、免疫沈降法にてASCと細胞骨格制御因子との結合の解析を試みたが、顕微鏡での観察により共局在が見られる分子はあったものの、結合は検出できなかった。おそらく、ASCとこれらの分子との結合が弱く、免疫沈降法で検出することが困難であると考えられる。このため、FRETなどの、細胞内分子間相互作用を可視化できるような実験系を用いて、ASCと相互作用する細胞骨格制御分子が存在するか否かを解析していく。また、ASCのノックダウンにより、Srcファミリーキナーゼのリン酸化が亢進するという結果が得られたが、このメカニズムについては不明なため、詳細な解析を試みる。以上の内容により、ASCの発現量低下によるがん細胞の転移能変化について考察する。
また、ASCは炎症に関与するアダプター分子であるため、炎症性刺激や、炎症時にASCと結合するNOD様受容体が、がん細胞の転移能に与える影響について解析を行う。現在用いているマウスメラノーマ細胞では、NOD様受容体の発現がほとんど認められないため、これらを発現させた際に細胞運動や浸潤突起形成に影響を与えるか否かについて解析を行う。さらに、NOD様受容体およびASCを発現している他のがん細胞株が炎症性刺激や細胞内容物に暴露された際の細胞運動や浸潤突起の形成に与える影響についても解析を試みる。
また、ASC発現量低下が浸潤突起形成に与える影響について、ASCノックアウトマウスより初代培養した細胞を用いて、同様に解析を行う。
以上の結果から、ASCの発現量低下によるがん細胞の転移能変化の分子機構と、炎症との関与について考察する。
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| Causes of Carryover |
本年度は、当初計画で見込んだよりも消耗品費、マウス購入費を節約できたため、次年度使用額が生じた。動物購入費用を計上していたが、マウスは購入せず、交配して維持しているマウスの中から余剰個体を使用したこと、および、当初の予定よりも細胞レベルの実験が多くなったため、動物購入・飼育の費用が予定より少なくなったこと等が理由としてあげられる。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度は、細胞レベルでの解析、生化学的実験による分子メカニズムの解析、動物実験を行う。また、本年度得られた成果の学会発表、論文発表を行う予定である。次年度使用額は、平成２７年度請求額と合わせてそれらに使用する。
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[Journal Article] NFkB2 Gene as a novel Candidate that Epigenetically Responds to Interval Walking Training2015
Author(s)
Y. Zang, S. Hashimoto, C. Fujii, S. Hida, K. Ito, T. Matsumura, T. Sakaizawa, M. Morikawa, S. Masuki, H. Nose, K. Higuchi, K. Nakajima, S. Taniguchi
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Journal Title
Int. J. Sportd Med.
Volume: in press
Pages: in press
DOI
Peer Reviewed
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