2016 Fiscal Year Research-status Report

上皮-間葉系転換（EMT）モデルシステムを利用したEMTメカニズムの解明

Research Project

Project/Area Number	26460273
Research Institution	Gifu University
Principal Investigator	本橋力岐阜大学, 大学院医学系研究科, 講師 (40334932)
Project Period (FY)	2014-04-01 – 2018-03-31
Keywords	上皮-間充織転換 / 間葉系細胞 / 神経堤細胞 / 直接転換 / レトロウィルス
Outline of Annual Research Achievements	平成28年度においては、以下の2つの研究を行った。 1. EMT現象に関する遺伝子の探索：EMT現象に関係すると推測した転写因子群を上皮系細胞にレトロウィルスを用いて過剰発現させて、EMT現象の発生の有無をフローサイトメーターと定量的PCRで調べた。間葉系細胞のマーカーであるSca-1、PDGFRαの発現を指標にスクリーニングをした結果、4つの転写因子を同時に発現することでマウス角化細胞からSca-1、PDGFRα両陽性細胞が顕著に出現することがわかった。しかも、Sca-1、PDGFRα両陽性細胞ではVimentinの発現が上昇し、E-Cadherinの発現が減少するという典型的なEMT現象が発生していることが観察された。今後、出現したSca-1、PDGFRα両陽性細胞の間葉系細胞としての性質を遺伝子発現と分化能を中心に調べる予定である。 2. EMT現象を用いた神経堤細胞への直接転換：平成27年度までの研究で、マウス線維芽細胞にSOX9もしくはSOX10を過剰発現させると、神経細胞、グリア細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞への分化能を持つ神経堤細胞に直接転換することを見出した。しかし、同じ方法では線維芽細胞以外の細胞を神経堤細胞へ直接転換することはできなかった。そこで、線維芽細胞以外の細胞の神経堤細胞への直接転換法の探索を行った。マウス角化細胞にSOX10と供に上記の研究1で明らかしたEMTに関係する転写因子を過剰発現させると、約10日で神経堤細胞のマーカーであるP75を発現する細胞が発生した。フローサイトメーターでP75陽性細胞を採取しRT-PCRを行ったところ、神経堤細胞のマーカー遺伝子Foxd3、Pax3等の発現が認められた。今後、P75陽性細胞の分化能を調べる予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 研究課題であるEMTの発生メカニズムの探索を進める中、予想しなかった新しい事象である線維芽細胞の神経堤細胞への直接転換が観察された。この現象は当研究課題の遂行に大きく影響を与え、今後大きく展開しうる可能性を秘めていた為、その研究を研究課題と並行して進める必要が生じた。さらに、組織改編により研究協力員を十分に確保できなかった。
Strategy for Future Research Activity	平成28年度の成果を元に、明らかにした転写因子の発現制御を薬剤誘導系や抑制系を用いて行ってEMTの亢進を調べ、さらに、これらの因子と既知のEMT関連分子との関係を解析し、EMT現象の分子ネットワークの解明をめざす。発生したSca-1、PDGFRα両陽性細胞の分化能等を調べ、間葉系細胞としての性質の有無も検討する。他の様々な細胞においても、この転写因子の組み合わせでEMTが起こるのかどうかも検討する。
Causes of Carryover	本研究と並行して、本研究から派生した成果である線維芽細胞の神経堤細胞への直接転換研究を行う必要が生じたため、当初の計画を大幅に変更した。
Expenditure Plan for Carryover Budget	前年度までに行った成果を元にして今後も転写因子のEMTでの役割と直接転換とEMTとの関連を調べる。経費は、引き続き行うフローサイトメーター解析のための各種蛍光抗体、遺伝子発現制御システム、遺伝子導入関連物品（遺伝子導入試薬、電気的遺伝子導入機器、レトロウィルス発現関連試薬）の購入に充てる。また、各種細胞培養のために必要な培養関連試薬、培地、さらにSox10-IRES-GFPマウスなど動物飼育費用等も計上している。