2015 Fiscal Year Research-status Report
腎糸球体ポドサイトでのミトコンドリア細胞内分布の意義
| Project/Area Number |
26460274
|
|---|
| Research Institution | Kyoto University |
|---|
Principal Investigator |
仲川 孝彦 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (60641595)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
李 頴 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (30437222) [Withdrawn]
小沢 将太 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (70643568) [Withdrawn]
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | ポドサイト / ミトコンドリア / 解糖系 / ＡＴＰ |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
ポドサイトの形態維持におけるミトコンドリアの役割を検討している。平成２６年度にはアデノウイルスを用いて、ポドサイトにミトコンドリア融合因子であるMfn2を過剰発現させ、ミトコンドリアと細胞形態との関係を調べた。その結果、Mfn2により集積したミトコンドリアの周囲には太いアクチン線維束が認められた。その一方で、ミトコンドリアが疎である部位ではlamelipodiaが形成されていた。したがって、lamellipodiaはミトコンドリア由来ATPではなく他のシステムによりその形態が維持されている可能性が考えられた平成２７年度は、そのlamellipodiaと解糖系由来ATPの関係を検討した。また細胞内ATP分布を明らかにするため、京都大学今村博臣博士との共同研究を行い、彼が開発したATeamというプローブを用いた。培養ポドサイトにおいては、ミトコンドリア機能を抑制しても、lamellipodiaは維持されたが、解糖系を阻害すると,lamellipodiaのATPレベルが低下し、それに伴い形態が維持できなくなることが明らかとなった。また、細胞の遊走能はlamellipodiaの機能に依存するといわれているが、解糖系を阻害すると、そのポドサイトの遊走能は低下した。一方でミトコンドリア阻害においてはその影響が認められなかった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
実験が順調に経過した理由は、細胞内ＡＴＰレベルをモニターすることに成功したからだと考えている。細菌のATP合成酵素の構成タンパク質の１つであるε（イプシロン）サブユニットはATP濃度に反応してその形態を変化させる。今回用いたATeamはそのATP合成酵素の性質を利用したものであり、今回は、ポドサイトにおいて細胞内ATPレベルの可視化に成功した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
解糖系の役割を確認するため、解糖系酵素を遺伝子操作する手法を用いる。これにはアデノウイルスをもちいて各酵素のSiRNAを細胞に導入し、その機能を抑制する。またin vivoポドサイトでのミトコンドリアの細胞内局在を確認し、培養細胞で認められたことが実際にマウスポドサイトでも認められるかどうかを確認する。ミトコンドリアの局在に関しては、ミトコンドリア可視マウスからの単離糸球体をもちいて検討する。また電子顕微鏡による確認も同時に遂行する。マウスにおける解糖系酵素の局在を検討するために、膜タンパクであるネフリンや細胞質タンパクであるシナプトポジンなどとの位置関係を検討する。
|
| Causes of Carryover |
本年度はマウス購入など高額な出費がなかったこと。また大学での任期切れのため、翌年度までにまたがる研究ができなかったこと。また培養実験などは在庫の試薬等で研究が行えたことなどが、研究費を使い切らなかった理由である。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
細胞培養実験では、細胞内ATP局在における解糖系の役割、特に主な解糖系酵素の役割を検討する。また動物実験としてでは、ポドサイトでのミトコンドリアおよび解糖系酵素のそれぞれの局在を明確にする。そのため、ミトコンドリア可視マウスやAtema発現マウス、あるいは解糖系酵素の遺伝子改変マウスを用いて、研究を進めていきたい。
|
