2015 Fiscal Year Research-status Report
大気圧走査電子顕微鏡を利用したニューロン微細構造観察のための新技法の確立
| Project/Area Number |
26460282
|
|---|
| Research Institution | Saitama Medical University |
|---|
Principal Investigator |
松本 英子 埼玉医科大学, 医学部, 助教 (00312257)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | 走査電子顕微鏡 / 大脳皮質ニューロン / 糸状仮足 / ネトリン-1 / 軸索ガイダンス |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では大気圧走査電子顕微鏡 (Atmospheric scanning electron microscope; ASEM) と呼ばれる新型の電子顕微鏡を活用し、培養ニューロンに存在する種々の微細構造の可視化に取り組んでいる。ASEMにおいては電子線を通す窒化シリコン製耐圧薄膜を備えた専用ディッシュを用いて、大気圧下に設置した試料の観察を行う (Nishiyama et al. (2010) J. Struct. Biol. 169, 438-449)。研究計画の二年目にあたる平成27年度は、先に確立した、ニューロン試料にリンタングステン酸による染色を施してASEM撮像を行う方法を利用し、胎生期マウス大脳皮質に由来する培養ニューロンにおいて軸索シャフト上の糸状仮足を観察した。
我々は軸索ガイダンス因子ネトリン-1が大脳皮質ニューロンで示す生理作用に関する研究を進めており、近年はおもに光学顕微鏡を用いた形態学的解析を行ってきた。その結果より、ネトリン-1が胎生14日 (E14) マウス大脳皮質由来の培養ニューロンにおいては軸索の伸長、E16マウス大脳皮質ニューロンにおいては軸索側枝の形成を促進することが示唆されている。本研究においてASEMによる糸状仮足の観察を行ったところ、E16マウス大脳皮質ニューロンをネトリン-1で刺激すると、軸索側枝形成に先立って軸索シャフト上の糸状仮足生成が促進されることが確認された。一方、E14ニューロンではネトリン-1処理の有無にかかわらず無刺激の状態においても、軸索シャフトに糸状仮足様の微細な突起が認められた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
E14マウス大脳皮質ニューロンにおいて得られた結果が予想に反するものであったことから、研究計画を変更してその確認と追究にあたり、ネトリン-1非依存的な糸状仮足様突起の存在を定量的解析によって示した。これに伴い、当初は当該年度中に実施する予定であった、大脳皮質ニューロン試料における免疫ASEM法の確立を目指した研究には遅れが生ずることとなった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
過去に蛍光ナノゴールド標識二次抗体を用いた免疫ASEM法が報告されているが、この方法にはASEM画像上のシグナルがドットの連なり･集まりとして現れるという特徴があり、目的とする構造の大きさや形状によっては適さない場合がある。本研究では上記の方法を大脳皮質ニューロンの観察に応用する試みに加え、元来の構造をより良く反映した免疫染色法を追究する目的で、ペルオキシダーゼ標識二次抗体を用いた免疫ASEM法の確立にも取り組む計画である。
免疫ASEM法が大脳皮質ニューロン試料においても実施可能となったならば、ネトリン受容体DCC (deleted in colorectal cancer) に対する抗体を用いた染色を行いASEMによる検鏡を試みる。過去に我々はハムスター新生仔大脳皮質に由来する培養ニューロンを用いて、ネトリン-1刺激に応じて軸索側枝の形成が行われる際には、細胞表面においてエキソサイトーシス依存的にDCCクラスターが形成されることを免疫染色試料の蛍光顕微鏡観察により見いだした。そこでこのリガンド依存的･エキソサイトーシス依存的に生ずる細胞表面DCCクラスターについても、免疫ASEM法による観察と解析を行う。さらにE14マウス大脳皮質ニューロンとE16ニューロンのそれぞれにおいて、ネトリン-1刺激によりDCCの分布にはどのような変化がおこるのか、特に細胞表面DCCクラスターの形成がみられるのか否かについて、抗DCC抗体による染色を施した試料のASEM観察を行ったうえで蛍光顕微鏡観察の結果とあわせて検討し、明らかにする計画である。
|
| Causes of Carryover |
培養ニューロンの光学顕微鏡観察に使用している画像取得･解析システムに老朽化による欠陥が生じたことから、平成26年度後半から27年度初めにかけて当該システムの更新を行った。当初の予定には含まれていなかったこの更新費用の発生に伴って研究計画全体を見直した結果、今回の次年度 (28年度) 使用額が生じた。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額と平成28年度新規請求分とを合わせ、これまでに得られた研究成果を公表するための費用に充てるとともに、培養ニューロンのASEM画像取得に掛かる費用、ならびにASEMに適した各種染色法を探索する目的で光学顕微鏡を用いて行う予備実験の際に必要となる実験動物･試薬･消耗品類の購入費に充当する計画である。
|
