2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of novel techniques for visualizing fine structures of neurons employing atmospheric scanning electron microscope
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26460282
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| Research Institution | Saitama Medical University |
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Principal Investigator |
松本 英子 埼玉医科大学, 医学部, 助教 (00312257)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 走査電子顕微鏡 / 大脳皮質ニューロン / 糸状仮足 / ネトリン-1 / 軸索ガイダンス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では大気圧走査電子顕微鏡 (Atmospheric scanning electron microscope; ASEM) と呼ばれる新型装置による培養ニューロン微細構造の可視化を目指した。これは電子線を通す耐圧薄膜を備えたディッシュを用いて溶液中など大気圧下試料の電子顕微鏡観察を行うものであるが、生命科学分野における活用法は未開拓であった。今回まずマウス胎仔・ハムスター新生仔大脳皮質由来の培養ニューロンにリンタングステン酸染色を施し、糸状仮足のASEM観察に成功した。デキストロース・没食子酸プロピルは撮像時の添加で退色防止効果を示した。
近年我々はニューロン軸索の分岐形成に注目しているが、これには成長円錐を介する様式と、軸索シャフトに糸状仮足が生じ、その一部が後に側枝となる様式の二通りが知られる。従ってシャフト上の糸状仮足生成は側枝形成の初期段階といえる。大脳皮質ニューロンでは、軸索ガイダンス因子ネトリン-1による側枝形成の促進が知られる。
先に確立したASEM検鏡法を利用すると、胎生16日 (E16) マウス大脳皮質ニューロンの軸索シャフトで、30分のネトリン-1刺激による糸状仮足の増加が観察された。一方、E14ニューロン軸索シャフトにはネトリン-1の有無に依らず糸状仮足様突起が認められた。
ASEM観察と微分干渉画像の定量的解析より以下の結論を得た。1) 大脳皮質由来の培養ニューロンで軸索伸長促進と軸索側枝形成促進という二つの異なるネトリン-1作用がみられた。2) ネトリン-1はE14ニューロンで軸索伸長、E16ニューロンで側枝形成を促進し、大脳皮質ニューロンにおけるネトリン-1の作用が発生段階で変化する可能性が考えられた。3) ネトリン-1受容体の一つDCCが軸索伸長と側枝形成の両方に関与することが示唆された。最終年度はこれらの成果を原著論文にまとめた。
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