2014 Fiscal Year Research-status Report
２光子励起蛍光寿命画像法を用いた膜融合関連蛋白の構造と機能解析
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26460290
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
高橋 倫子 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (60332178)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 分泌 / 膜融合 / シナプス伝達 / インスリン / 蛍光色素 / 蛍光寿命 / 2光子励起 / イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
大脳皮質培養神経の軸索終末と膵島標本において、細胞膜側SNARE(t-SNARE)と小胞膜側SNARE（v-SNARE）の複合化を、分子間FRETプローブと2光子励起蛍光寿命画像法で調べた。分子のN末（細胞質側）標識プローブ発現時には、神経終末では約30％の複合化率を認めたのに対し、膵島標本では複合化は0－5％程度と有意に抑制されていることを認めた(論文投稿中)。さらに、神経においては、30％のうち10％は膜融合後の cis-SNARE 構造が反映されていることを突き止め、残りの 20 ％ が開口放出の準備段階に当たる trans-SNARE 構造を反映することを明らかにした。CA1 海馬スライス標本でさらなる検討を進めた結果、シナプス前部の SNARE 複合化は、シナプス後部構造スパインのサイズと相関した。一方、シナプス前部の放出確率をシナプス後部におけるカルシウムイメージングで検討した結果、大きなスパインに面するシナプス前部において、より大きな放出確率が見られた。これらの事実より、SNAREの複合化率は放出確率に関与することが示唆された。さらに我々は SNAP25欠損マウスより単離培養した神経標本に、蛍光標識したSNAP25分子やSNAP25 の各種変異体を導入し、蛍光標識体のみが膜融合に機能する環境を作った。そして、伝達物質放出のキネティクスとSNAP25の複合化構造の関連を、パッチクランプ法と蛍光寿命画像法を組み合わせて解析した結果、アクティブゾーンでは SNAP25のひとつのαヘリックスは他のSNAP25分子のαヘリックスと複合化するdomain swapping 構造が形成されされている可能性のあるデータを得ている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
複数種類の細胞や異なる組織(培養細胞あるいはスライス標本）を用いて、蛋白の複合化・構造と機能との関連を多層的に調べる作業を行っている。ウィルスベクターを用いた遺伝子導入技術やSNARE蛋白欠損動物からの細胞培養技術の確立に大学院生が成功している。
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| Strategy for Future Research Activity |
定量的な分泌誘導を行うために、新規のケイジドカルシウム試薬の利用を検討している。より大きなカルシウム上昇を神経細胞に与えることにより IPSC のみならず EPSC で機能評価を行う計画も持っている。また、インスリン細胞における検討も進めるとともに、副腎髄質細胞株 :PC12での予備実験も開始しており、比較対象としながら研究を継続して遂行する。
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| Causes of Carryover |
旅費を少なく抑え、実験用消耗品の購入量が抑制されたことが原因と考えられる。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度以降の旅費・物品費（培養用消耗品・試薬代）などに充てる予定である。
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