Analysis of structure and function of proteins involved in membrane fusion using two-photon fluorescence lifetime imaging

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26460290
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 高橋 倫子 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 講師 (60332178)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 神経 / シナプス / 伝達 / 開口放出 / 膜融合 / 蛋白質

Outline of Annual Research Achievements

SNAP25 のオリゴマー化がマウス神経細胞における超高速の伝達物質放出に重要であることを、2系統のSNAP25変異体を用いて証明した。実験ではSNAP25欠損マウスから単離培養した大脳皮質神経細胞を用いた。FRETプローブとして、ドナー色素をN末に結合させたmturquoise(mtq)-SNAP25 と、アクセプター色素を第二αヘリックスの直前に挿入したSN1-Venus(Ven)-SN2の二種を基本形とした。両者のFRETは、2光子励起蛍光寿命画像法を用い、軸索終末領域で計測した。通常は約15%の結合率を示し、免疫組織染色で、シナプス前終末分子：Basoonと共局在した。
第一にSNAP25のC末欠損体でプローブを作成した。7残基欠損体では結合率に変化は見られず、9残基欠損体では結合率が有意に減弱した。この際、20Hz 電気刺激を与えてシナプス伝達（IPSC）を計測すると、Δ9変異体では第一刺激による伝達が見られず、刺激を反復させると遅れた伝達が検出された。また、刺激後伝達までの潜時はΔ9で有意に延長した。以上より、SNAP25のC末はSNAP25の オリゴマー化（domain-swapping 構造形成）に必要で、速い伝達物質放出に関与することが示唆された。
第二に、SNAP25の二つのヘリックスを連結するリンカーの延長変異体を作成した。12残基～20残基延長体のいずれも、結合率は対照と同等だった。しかし、IPSCは、10残基以上の延長で有意な遅れが検出された。また、第一回刺激におけるIPSCの振幅も、10残基以上の延長で有意に減弱した。以上より、リンカーを延長させてもドメイン構造は構成されるが、適切なリンカー長が速い放出を起こすのに必須で、それは融合細孔を取り巻くSNARE複合体間（SNAP25リンカー領域）の張力に反映されると考察された。

Research Products

• [Journal Article] Munc18b increases insulin granule fusion, restoring deficient insulin secretion in type-2 diabetes human and Goto-Kakizaki rat islets with improvement in glucose homeostasis. (2017)
  • Author(s): Qin T, Liang T, Zhu D, Kang Y, Xie L, Dolai S, Sugita S, Takahashi N, Ostenson CG, Banks K, Gaisano HY
  • Journal Title: EBioMedicine Volume: 16 Pages: 262-274
  • DOI: 10.1016/j.ebiom.2017.01.030
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Design and synthesis of a new chromophore, 2-(4-nitrophenyl)benzofuran, for two-photon uncaging using near-IR light. (2016)
  • Author(s): Komori N, Jakkampudi S, Motoishi R, Abe M, Kamada K, Furukawa K, Katan C, Sawada W, Takahashi N, Kasai H, Xue B, Kobayashi T.
  • Journal Title: Chem Commun (Camb) Volume: 52 Pages: 331-334
  • DOI: 10.1039/c5cc07664a.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Design and Synthesis of a 4-Nitrobromobenzene Derivative Bearing an Ethylene Glycol Tetraacetic Acid Unit for a New Generation of Caged Calcium Compounds with Two-Photon Absorption Properties in the Near-IR Region, and Their Application In Vivo. (2016)
  • Author(s): Jakkampudi S, Abe M, Komori N, Takagi R, Furukawa K, Katan C, Sawada W, Takahashi N, Kasai H.
  • Journal Title: ACS Omega Volume: 1 Pages: 193-201
  • DOI: 10.1021/acsomega.6b00119
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Opposing roles for SNAP23 in secretion in exocrine and endocrine pancreatic cells. (2016)
  • Author(s): Kunii M, Ohara-Imaizumi M, Takahashi N, Kobayashi M, Kawakami R, Kondoh Y, Shimizu T, Shimizu S, Lin BZ, Nunomura K, Aoyagi K, Ohno M, Ohmuraya M, Sato T, Yoshimura S, Sato K, Harada R, Kim YJ, Osada H, Nemoto T, Kasai H, Kitamura T, Nagamatsu S and Harada A.
  • Journal Title: J Cell Biol Volume: 214 Pages: 121-138
  • DOI: 10.1083/jcb.201604030
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] State-dependent diffusion of actin-depolymerizing factor/cofilin underlies the enlargement and shrinkage of dendritic spines. (2016)
  • Author(s): Noguchi J, Hayama T, Watanabe S, Ucar H, Yagishita S, Takahashi N, Kasai H.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 6 Pages: ―
  • DOI: 10.1038/srep32897.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Configuration of SNAP25 at the exocytic sites analyzed with 2-photon excitation FLIM (2017)
  • Author(s): Takahashi N, Watanabe S, Sawada W, Kasai H.
  • Organizer: 第94回日本生理学会大会
  • Place of Presentation: アクトシティ浜松（静岡県浜松市）
  • Year and Date: 2017-03-29
• [Presentation] Two-photon fluorescence lifetime imaging of primed SNARE complexes. (2016)
  • Author(s): Takahashi N, Sawada W, Noguchi J, Hasan U, Watanabe S, Kasai H.
  • Organizer: 第39回日本神経科学学会大会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-07-22
  • Invited