Effects of synaptotagmin binding on SNARE-mediated fusion and trans-SNARE complex formation

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26460297
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 西木 禎一 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (70423340)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 神経科学 / 刺激分泌連関 / シナプス小胞 / カルシウムイオン / 開口放出

Outline of Annual Research Achievements

リポソームに再構成したシンタキシンへのシナプトタグミン結合：当初は、蛍光標識したＴスネアへテロ二量体を透析法によりリポソームに組込む予定であったが、再構成率が低かったためアセトン沈降法に変更した。リポソームに再構成したＴスネア中のシンタキシンにシナプトタグミンが結合するか調べたところ、Ｓ１８８ＣおよびＳ２４９Ｃ変異シンタキシンのいずれもシナプトタグミンの細胞質フラグメントと等モル以上の比で結合し、アセトン処理後もシナプトタグミン結合能を保持していることが示された。

スネア複合体形成に及ぼすシナプトタグミン結合の影響：シンタキシンへのシナプトタグミン結合がスネア複合体形成に及ぼす影響を調べた。Ｃｙ３で蛍光標識したシンタキシンを含むＴスネアリポソームを、シナプトタグミン細胞質フラグメント存在下および非存在下で、Ｃｙ５標識シナプトブレビン細胞質フラグメントと反応させた。シナプトタグミン存在下でのアミノ末端標識ペアのＦＲＥＴ効率は非存在下と同程度であった。シナプトタグミン存在下でのカルボキシ末端標識ペアのＦＲＥＴ効率は非存在下に比べ約２０％低かったが、有意差は認められなかった（ｐ＝０．０６）。カルボキシ末端標識ペアのシンタキシンおよびシナプトブレビンの蛍光標識部位はともにスネアモチーフの第６層と第７層の間に位置することから、シナプトタグミンが結合しても、スネア複合体は少なくともモチーフの第６層まで会合していることが示唆された。