マクロピノサイトーシスによる膜動態変化依存的な神経回路形成機構の解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26460309
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 樺山 博之 国立研究開発法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 研究員 (10332339)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: マクロピノサイトーシス / 反発性軸索誘導 / エンドサイトーシス / 成長円錐 / syntaxin

Outline of Annual Research Achievements

反発性軸索誘導は間違ったシナプス形成をしないために必須であり、世界中でその分子メカニズムの研究がアクチン骨格系制御分子の解析を中心に行われてきた。しかし、研究代表者はマクロピノサイトーシスという特殊なエンドサイトーシスによる大規模な細胞形質膜の回収が神経突起成長円錐の退縮や神経突起伸長の抑制に必須であることを世界に先駆けて発見した。本研究では、従来の研究では全く注目されていなかった、マクロピノサイトーシスによる膜動態変化依存的な神経回路形成機構を、分子、細胞、個体レベルで明らかにすることを目的とする。

マクロピノサイトーシスの負の制御因子としてsyntaxin1Bを同定しているが、syntaxin1Bがどのようにマクロピノサイトーシスを制御しているかは不明である。また、成長円錐のマクロピノサイトーシスは細胞外からのカルシウム流入や、細胞内カルシウムストアからのカルシウム放出によっても誘導されることをすでに報告済みであるが、その分子制御メカニズムは不明である。平成２７年度には、syntaxin1Bの結合分子として見出した細胞内の小胞体のカルシウムチャネルである、IP3受容体(IP3R)のsyntaxin1B結合ドメインの機能解析を進め、この結合ドメインを神経特異的プロモーターであるsynapsinIプロモーターによって神経特異的に発現するレンチウイルスベクターの作製を行い、高力価のレンチウイルスベクターの作製に成功した。このウイルスベクターを用いて培養神経細胞に効率よくsyntaxin1B結合ドメインを発現させることに成功した。

また、マクロピノサイトーシス阻害剤の標的分子であるナトリウムープロトン交換体（NHE1）のゲノム編集技術を用いたノックアウトマウスの作製に着手した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

高力価のウイルスベクターの作製に成功した。また、ゲノム編集技術を用いてマクロピノサイトーシスの正の制御因子である
NHE1のコード領域に、ノンセンス変異を入れたノックインマウスの作製に成功した。

Strategy for Future Research Activity

NHE1ノックアウトマウスは、現在B6系統の野生型マウスと戻し交配を行っている。この進展によって、個体レベルでの脳神経系のマクロピノサイトーシスの可視化と定量を試みる。これに成功すれば、IP3Rノックアウトマウスや、syntaxin1B結合ドメインを発現させた細胞において、マクロピノサイトーシスがどのような影響を受けるかを調べていく。