2015 Fiscal Year Research-status Report
ヒスタミンＨ３受容体の細胞内輸送と機能的シグナロソーム形成の分子基盤解析
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26460331
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
助川 淳 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 非常勤講師 (30187687)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柳澤 輝行 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90133941)
佐藤 岳哉 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (10312696)
斎藤 将樹 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50400271)
倉増 敦朗 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90302091) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | Gタンパク質共役型受容体 / ヒスタミンH3受容体 / シグナロソーム / Rab8 / 細胞内輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒスタミンH3受容体 (H3R) はGタンパク質共役型受容体 (GPCR) の一種であり、中枢および末梢神経系において、神経伝達物質放出に対し抑制的に関与する。Rab8は膜タンパク質のゴルジ体から細胞膜への輸送を制御するタンパク質である。申請者は既に、H3Rのカルボキシル (C) 末端にRab8が直接相互作用することを見出している。そこで本研究では、H3Rの細胞内分布におけるRab8の役割について解析した。最初に、Rab8との結合に関与するアミノ酸配列を検討するため、H3RのC末端を様々な部位で切断しin vitro pull-down assayを行った。その結果、ヘリックス8の9アミノ酸が重要であることが見出されたため、それらをそれぞれアラニンに置換したところF419、K425およびL426がRab8との結合に関わることが見出された。これらのアミノ酸は、ヘリックス8の疎水性側に分布する。一方、H3Rの細胞内分布におけるRab8の役割を検討するため、緑色蛍光色素アザミグリーン融合H3RをCHO細胞に安定発現した。その結果、H3Rは主に細胞膜に分布することが見出された。しかし、野生型 (WT) および活性化型変異体 (Q67L) Rab8を過剰発現すると、H3Rの細胞膜分布は減少し、主に細胞内の小胞上に分布した。不活性化型変異体 (T22N) Rab8の過剰発現はH3Rの細胞内分布に影響しなかった。以上のことから、H3RはC末端のヘリックス8を介してRab8と直接相互作用することによって、細胞内に分布することが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの研究成果により、H3R中に、Rab8と直接相互作用するアミノ酸配列を同定することが出来た。また、緑色蛍光色素融合H3Rを安定発現した安定細胞株を樹立することにより、活性化Rab8がH3Rの細胞内局在を安定化することが示された。特に、本実験はH3Rアゴニスト非存在化で行っているため、Rab8の恒常的な活性によるものと考えられる。このように、H3Rの細胞内分布におけるRab8の直接相互作用の役割を検討することが出来たため、当該年度に予定していた研究は、全体的におおむね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度では、WTおよびQ67L-Rab8の過剰発現によってH3Rが主に細胞内小胞上に分布する結果を得た。そこで今後、内因性Rab8がH3Rの細胞内分布に関わるか検討するため、Rab8のノックダウンを行う。また、H3Rが分布する小胞の種類を明らかにするため、主に免疫染色法を行う。また、見出された小胞において、H3RとRab8の共局在も検討する。
H3RはGi共役型GPCRであることから、H3Rを介したGiシグナルにおけるRab8の役割を検討する。サイクリックAMP産生量はAlphaScreen法で、extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) リン酸化はWestern blottingにてそれぞれ検討する。さらに、H3Rアゴニスト刺激後の細胞内H3R分布の変化についても、Rab8との直接相互作用の観点から検討する。
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| Causes of Carryover |
研究は概ね計画通りに進捗したが、当初の予定より物品費が節約出来たため、次年度使用額が発生した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度は最終年度のため、論文投稿料として200千円を充てる。また、国内学会参加費として、100千円を充てる。
その他は物品費として使用する。
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[Journal Article] Involvement of the histamine H1 receptor in the regulation of sympathetic nerve activity.2015
Author(s)
Murakami M, Yoshikawa T, Nakamura T, Ohba T, Matsuzaki Y, Sawamura D, Kuwasako K, Yanagisawa T, Ono K, Nakaji S, Yanai K
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Journal Title
Biochemical and Biophysical Research Communications
Volume: 458
Pages: 584-589
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Mitochonic acid 5 (MA-5), a derivative of the plant hormone indole-3-acetic acid, improves survival of fibroblasts from patients with mitochondrial diseases.2015
Author(s)
Suzuki T, Yamaguchi H, Kikusato M, Matsuhashi T, Matsuo A, Sato T, Oba Y, Watanabe S, Minaki D, Saigusa D, Shimbo H, Mori N, Mishima E, Shima H, Akiyama Y, Takeuchi Y, Yuri A, Kikuchi K, Toyohara T, Suzuki C, Kohzuki M, Anzai J, Mano N, Kure S, Yanagisawa T, Tomioka Y, Toyomizu M, Ito S, Osaka H, Hayashi K, Abe T
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Journal Title
The Tohoku Journal of Experimental Medicine
Volume: 236
Pages: 225-232
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Mitochonic acid MA-5 binds to mitochondria and ameliorates renal tubular and cardiac myocyte damages.2015
Author(s)
Suzuki T., Yamaguchi H., Kikusato M., Hashizume O., Nagatoishi S., Matsuo A., Sato T., Kudo T., Matsuhashi T., MurayamaK., Ohba Y., Watanabe S., Kanno S.-I., Minaki D., Saigusa D., Shinbo H., Mori N., Yuri A.,Yokoro M., Mishima E., Shima H., Akiyama Y., Yanagisawa T., et. al
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Journal Title
Journal of the American Society of Nephrology
Volume: 27
Pages: in press
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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