2014 Fiscal Year Research-status Report
スフィンゴシン1-リン酸シグナリングによる癌転移メカニズムの解明
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26460341
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
梶本 武利 神戸大学, 大学院医学研究科, 助教 (00509953)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | スフィンゴシンキナーゼ / スフィンゴシン-1-リン酸 / スフィンゴシン-1-リン酸受容体 / エクソソーム / 癌転移 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、申請者らが発見したS1Pシグナリングによるエクソソームへの積み荷ソーティング機構が癌転移を促進する積み荷（タンパク質やmiRNAなど）においても適用されることを細胞レベルおよび動物レベルで明らかにすることで、癌転移におけるS1Pシグナリングの役割を解明することを目的としている。
平成２６年度は、「課題１」である「S1Pシグナリングによりエクソソームへソーティングされる癌転移関連物質の同定」を行った。
癌転移関連物質としては、癌の転移に関係するタンパク質およびmiRNAのそれぞれについて検討を行った。また評価に用いる細胞としては転移性の高い癌細胞株であるB16F10細胞などを用いた。具体的には、タンパク質やmiRNAのエクソソームへのソーティングを抑えるためにSphKやS1P受容体に対する阻害剤を処置し、細胞培養上清中のエクソソームを超遠心法により回収し、エクソソーム積み荷定量法によりエクソソーム中のタンパク質またはmiRNAの密度を定量化することで、S1Pシグナリングによりエクソソームへのソーティングの制御を受ける癌転移関連物質をスクリーニングした。この際miRNAについては外来のmiRNAについて検討を行った。その結果、スクリーニングを行ったタンパク質およびmiRNAの中で数種のタンパク質、miRNAがS1Pシグナリングによりエクソソームへソーティングされることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２６年度は、本研究課題の最終的な目標の達成に向けて、「課題１」の「S1Pシグナリングによりエクソソームへソーティングされる癌転移関連物質の同定」を中心に研究を進め、結果S1Pシグナリングの制御を受ける数種の癌転移関連タンパク質およびmiRNAを同定することが出来た。一方で「課題１」の中で癌転移関連miRNAの結果は外来性のmiRNAに関するものであり、現在内在性のmiRNAについても同様の実験を行い、確認作業を進めている。現在までのところ研究期間全体を通しておおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２７年度は、「課題２」の「エクソソームが関与する癌転移におけるS1Pシグナリングの役割の解明」を中心に研究を進め、「in vivo癌転移イメージングに向けたルシフェラーゼおよびshRNAの安定発現細胞の構築」および「in vivo癌転移イメージング実験系の確立」までを行う。
具体的には、まずほ乳類細胞の発現プロモーター（CMVなど）の下流で赤色ホタルルシフェラーゼが発現するプラスミドベクターをB16F10などの高転移性の癌細胞株に遺伝子導入し、赤色ホタルルシフェラーゼの安定発現癌細胞株をクローニングする。次にS1Pシグナリング関連分子であるSphK2、S1P受容体およびコントロールのshRNAプラスミドベクターをそれぞれルシフェラーゼ安定発現癌細胞株に遺伝子導入し、ルシフェラーゼとSphK2 shRNA、S1P受容体shRNAまたはコントロール shRNAのダブル安定発現癌細胞株のクローニングを行う。最後に抗SphK2抗体、抗S1P受容体抗体を用いたウエスタンブロット法によりshRNAによるSphK2、S1P受容体の発現抑制の確認を行う。構築したルシフェラーゼ/SphK2 shRNAダブル安定発現株およびルシフェラーゼ/S1P受容体shRNAダブル安定発現株において、「課題１」で同定した癌転移関連物質のエクソソームへのソーティングが有為に減少していることを課題１と同様の方法により細胞レベルで確認する。また「in vivo癌転移イメージング実験系の確立」として、構築したルシフェラーゼ/コントロールshRNAダブル安定発現株を用いて、生体イメージング蛍光観察装置によるマウスにおける肺への癌転移実験系の確立を行う。
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| Causes of Carryover |
癌の転移に関係するタンパク質の検討において予定よりもスムーズに期待した結果を得ることが出来たため、エクソソームの積み荷タンパク質を検出するための抗体およびエクソソームを標識するための色素類の支出が下がった。一方で共同施設利用費の料金改定に伴い利用料が大幅に上昇したためその他の支出が上がった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成２７年度の研究費は、平成２６年度に引き続き主に消耗品費および共同施設利用費として使用する。またこれまでの成果を学会などで発表するための旅費として使用する。
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