2015 Fiscal Year Research-status Report
スフィンゴシン1-リン酸シグナリングによる癌転移メカニズムの解明
| Project/Area Number |
26460341
|
|---|
| Research Institution | Kobe University |
|---|
Principal Investigator |
梶本 武利 神戸大学, 大学院医学研究科, 助教 (00509953)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | エクソソーム / スフィンゴシン-1-リン酸 / スフィンゴシンキナーゼ / スフィンゴシン-1-リン酸受容体 / 癌転移 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、申請者らが発見したS1Pシグナリングによるエクソソームへの積み荷ソーティング機構が癌転移を促進する積み荷（タンパク質やmiRNAなど）においても適用されることを細胞レベルおよび動物レベルで明らかにすることで、癌転移におけるS1Pシグナリングの役割を解明することを目的としている。
平成２７年度は、「課題２」である「in vivo癌転移イメージングに向けたルシフェラーゼおよびshRNAの安定発現細胞の構築」を行った。
まず、高転移性のマウス乳がん細胞株である4T1細胞、ヒトメラノーマ細胞株であるMeWo細胞およびマウスメラノーマ細胞株であるB16F10細胞に、ほ乳類細胞の発現プロモーター（CMV）の下流でホタルルシフェラーゼが発現するプラスミドベクターを遺伝子導入し、ホタルルシフェラーゼの安定発現細胞株をクローニングした。次にS1Pシグナリング関連分子であるスフィンゴシンキナーゼ２（SphK2）およびコントロールのshRNAプラスミドベクターを、それぞれルシフェラーゼ安定発現癌細胞株に遺伝子導入し、ルシフェラーゼとSphK2 shRNAまたはコントロール shRNAのダブル安定発現癌細胞株のクローニングを行った。SphK2の発現抑制の確認は、抗SphK2抗体によるウエスタンブロット法および外来SphK2-GFPの発現抑制効果の２通りの方法で行った。結果、マウス乳がん細胞株である4T1細胞およびヒトメラノーマ細胞株であるMeWo細胞においてルシフェラーゼを発現し、かつSphK2の発現が有意に抑制されたダブル安定発現株を得た。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２７年度は、本研究課題の最終的な目標の達成に向けて、「課題２」の「in vivo癌転移イメージングに向けたルシフェラーゼおよびshRNAの安定発現細胞の構築」を中心に研究を進め、結果、マウス乳がん細胞株である4T1細胞およびヒトメラノーマ細胞株であるMeWo細胞において、ルシフェラーゼ発現かつSphK2発現抑制のダブル安定発現株を得た。マウスメラノーマ細胞株であるB16F10細胞については、残念ながら有効な安定発現株を得ることができなかったが、現在CRISPR-CAS9システムによるゲノム編集技術を用いてマウスメラノーマB16F10細胞のSphK2ノックアウト細胞株の作製を進めている。現在までのところ研究期間全体を通しておおむね順調に進展している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
平成２８年度は、「課題２」の「S1Pシグナリングによるエクソソームソーティング機構の癌転移における重要性の解明」を中心に研究を進める。
具体的には、平成２７年度に作製した、マウス乳がん細胞株である4T1細胞およびヒトメラノーマ細胞株であるMeWo細胞のルシフェラーゼ-SphK2 shRNAダブル安定発現株、あるいは現在作製中のマウスメラノーマB16F10細胞のルシフェラーゼ安定発現SphK2ノックアウト細胞株を用いて、生体イメージング蛍光観察装置によるマウスにおける肺への癌転移実験を行い、SphK2ノックダウンおよびノックアウトの効果を検討し、さらにコントロール細胞由来のエクソソームによるレスキュー効果の検討を行う。
このようにして、癌転移関連物質のS1Pシグナリングによるエクソソームソーティング機構と癌転移との関連をin vivoのレベルで明らかにする。
|
