2016 Fiscal Year Research-status Report
β型グロビン遺伝子のエピジェネティック制御におけるDNAメチル基転移酵素1の役割
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26460355
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
田邉 修 東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 教授 (70221398)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 未来子 東北大学, 医学系研究科, 講師 (80508309)
横澤 潤二 東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 非常勤講師 (10722605)
西川 慧 東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 研究支援者 (40722616) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 遺伝子発現制御 / βグロビン異常症 / DNAメチル基転移酵素1 / 胎児型γグロビン / ヒストン修飾 / DNAメチル化 / エピジェネティクス / ヘモグロビンスイッチング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
サラセミアや鎌状赤血球症等のβグロビン異常症の治療として、胎児型γグロビン誘導療法が有効であるが、そのような効果の薬剤として広く使用されるのはヒドロキシ尿素のみであり、しかも本剤が有効なのは鎌状赤血球症患者の約半数に過ぎず、サラセミアに対しては殆ど無効である。骨髄抑制等の副作用により投与が制限されることも問題である。より安全で有効なγグロビン誘導剤の開発が望まれるが、それには胎児型γグロビン遺伝子の、出生後の不活性化機構の解明が重要である。本研究ではDNAメチル基転移酵素1 （Dnmt1）のγグロビン遺伝子不活性化における役割を明らかにするために、以下の3種の変異を導入した複合変異マウスの解析を行う。（1）配列特異的組換え酵素Creの作用でDnmt1を欠失する変異Dnmt1遺伝子（Dnmt1 Floxアレル）、（2）赤血球系でのみCreを発現するCreノックインEpor遺伝子（Epor Creアレル）、（3）ヒトβ型グロビン遺伝子座の挿入変異、以上の3種の変異である。これら全てを保有する複合変異マウスでは、初期発生に必須なDnmt1の欠損を赤血球系特異的に誘導できると期待され、Dnmt1のγグロビン遺伝子不活性化における役割と、γグロビン誘導剤開発のための分子標的としての意義を解明できる。このような解析のためには、減数分裂組換えによって、Dnmt1 FloxアレルとEpor Creアレルとが同一染色体上に連結したハプロタイプのマウスを取得する必要がある。しかし、この組換え効率が当初予測より低かったため、当初計画通りに前年度中にこのような減数分裂組換え体を取得できなかった。このため平成28年度も、このような組換え体の取得を目的として、Dnmt1 FloxアレルとEpor Creアレルとが異なる染色体上に存在する複合変異マウスと、野生型マウスとの間の交配を継続した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成28年度には赤血球系細胞において、Dnmt1遺伝子のFloxアレルがCreによる配列特異的DNA組換えによって欠損アレルへと変換される効率を測定する計画であった。具体的には、Dnmt1遺伝子Floxアレルと欠損アレルの複合ヘテロ接合体変異マウスに、Epor遺伝子を利用してCreを赤血球系特異的に発現させた上で、胎児肝及び成獣脾より抽出したDNAを用いて、Creによる欠失領域を検出する定量PCR解析により、Floxアレルから欠損アレルへの変換効率を確認する計画であった。前年度から引き続いて、平成28年度も、この計画を実施するのに必要なマウスを得るための交配・繁殖を行った。Dnmt1遺伝子とEpor遺伝子とは同一染色体上に存在するため、減数分裂組換えによってDnmt1 FloxアレルとEpor Creアレルとが同一染色体上に連結したハプロタイプのマウスの作成が必要であるが、両遺伝子間の距離は、わずか1メガ塩基であるため、それらの遺伝学的距離はわずか約0.6 センチモルガン程度である。つまり、Dnmt1遺伝子とEpor遺伝子との間での減数分裂組換えが生じるのは、およそ170減数分裂に1回であることから、Dnmt1 FloxアレルとEpor Creアレルとを異なる染色体上に持つマウスと野生型マウスとの交配で得られる仔マウス340匹に1匹が、期待するハプロタイプを持つマウスであると予測される。28年度には、234匹の仔マウスの遺伝子型判定を行ったが、期待するハプロタイプのマウスは取得できなかった。このため、上記計画にそってDnmt1遺伝子のFloxアレルから欠損アレルへの変換効率を測定することができなかった。一方、Dnmt1欠損アレルとヒトβ型グロビン遺伝子座の挿入変異とを持つ複合変異マウスは前年度に取得できたので、これを繁殖させた。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度にはDnmt1 FloxアレルとEpor Creアレルとを異なる染色体上に持つマウスと、野生型マウスとの間の交配を継続し、得られた234匹の仔マウスの遺伝子解析の結果では、この研究に必要な、Dnmt1 FloxアレルとEpor Creアレルとが同一染色体上に連結したハプロタイプを持つ減数分裂組換え体マウスは取得できていない。平成29年度の前半に、28年度の7倍程度、すなわち1600匹程度の仔マウスを取得すべく交配を継続する。確率論的には、この交配で得られる仔マウス340匹に1匹が目的とするハプロタイプの組換え体マウスであるため、1600匹程度の仔マウスを得れば、目的のマウス4～5匹程度を取得できると予測される。この交配では１腹から8匹前後の仔が生まれるため、計200腹程度の仔が得られれば、1600匹程度の仔マウスを取得できる。今年度は、この交配に50匹のメスを使用する計画であり、メス1匹につき3～4腹が得られれば、計200腹程度の仔マウスが取得できる。これに要する期間は、4ヶ月程と推定されることから、平成29年8月までには、Dnmt1 FloxアレルとEpor Creアレルとが同一染色体上に連結したハプロタイプを持つマウスを取得できると予測される。その後、このマウスにヒトβ型グロビン遺伝子座のトランスジーンを交配により導入して繁殖させたうえで、胎仔肝と成獣脾を採取し、これより抽出したDNAを用いて、Creによる欠失領域を検出する定量PCR解析により、Floxアレルから欠損アレルへの変換効率を確認する。同時に、これら臓器より抽出したRNAを用いて、逆転写定量PCR法によりヒトβ型グロビンmRNAを定量し、胎児型γグロビン遺伝子の発現上昇（脱抑制）の有無を調べる。このようにして、ヒトβ型グロビン遺伝子群の発現に対するDnmt1欠損の影響を解析する。
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| Causes of Carryover |
代表者らは、平成28年度には、Dnmt1 FloxアレルとEpor Creアレルとが連結したハプロタイプを持つマウスを交配により取得し、赤芽球系細胞より抽出したDNAを用いてFloxアレルから欠損アレルへの変換効率を測定する計画であった。同年度中に、この計画に必要なマウスを得るための交配・繁殖を行い、234匹の仔マウスのDnmt1遺伝子とEpor遺伝子の遺伝子型判定を行ったが、期待するハプロタイプのマウスは取得できなかった。このため、上記計画にそってDnmt1遺伝子のFloxアレルから欠損アレルへの変換効率の測定を実行できず、そのための繁殖に使用する予定であった野生型マウス、動物実験施設使用料や、定量PCR解析に使用する予定であった酵素・試薬等、プラスチック器具等の購入費用が次年度（29年度）に繰越されることとなった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額は、合計 1,935,701円である。このうち545,701円を消耗品費に、490,000円をサーマルサイクラーに、400,000円を卓上微量高速遠心機に、400,000円を動物実験施設使用料に、100,000円を旅費等に充てる計画である。消耗品費545,701円の内訳は、購入費として野生型マウスに250,000円、酵素・試薬等に200,000円、プラスチック器具等に95,701円を充てる。うち、野生型マウスの用途は、目的とする遺伝子型を持つマウスを取得するための交配・繁殖である。酵素・試薬等、プラスチック器具等の用途としては、PCR法によるマウスの遺伝子型判定や、赤血球系細胞におけるDnmt1遺伝子Floxアレルの欠損アレルへの変換効率を測定するための定量PCR解析、逆転写定量PCR法によるヒトβ型グロビンmRNAの定量解析等である。
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