2014 Fiscal Year Research-status Report
細胞リプログラミングへのシチジンデアミナーゼの関与
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26460363
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
長岡 仁 岐阜大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20270647)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 克哉 岐阜大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60733508)
木村 正志 岐阜大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (40260575)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 再生医学 / DNA脱メチル化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、iPS作製過程で重要なDNA脱メチル化現象に関与が示唆されているAIDを中心に、その他のデアミナーゼ並びに TET ファミリータンパク質の役割を解析し、リプログラミングに際してのDNA メチル化制御に関する知見を得る事を目的とする。iPS 樹立過程でのAID発現を単細胞レベルで解析し、多能生獲得とAID発現の条件を詳細に明らかにするために、計画に従いAID発現細胞の短細胞レベルでのモニタリングができるトランスジェニックマウスからMEFを作成を行った。作成過程で0.3-2％のMEFがAicda遺伝子発現後マーカー陽性であることを見出した。このことから、今回新たに、特にリプログラミング誘導のなされていない維持培養の状態においてもMEFの一部にAIDが発現することが示唆された。
上記の新たな知見によりMEF中のspontaneousなAID発現の効率が想定外に高率な場合、当初の解析計画に変更が必要となる恐れがあったことと、また、逆に発現を適度に促進する条件を見出せればその条件を効率的解析に利用できると考え、様々な条件下でのMEFの培養とAID発現マーカーの解析を行った。その結果、維持培養だけではAID発現細胞の比率は長期（8週以上）に渡り３%を超えない事。また、細胞密度、培養期間、物理的刺激によるAID発現への明らかな影響は認められない事。などを確認し、iPS誘導における解析が可能であると判断した。
AID以外に同時にリプログラミングに有効な候補として脱メチル化反応を誘導するTETファミリー遺伝子群の発現をRT-PCRで確認しMEFにおいてはTET1,2が主に発現することを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
MEF培養時に当初想定していなかったリプログラミング開始前からのAID発現マーカー陽性細胞の存在が明らかになり、リプログラミングとマーカー陽性化頻度の観察を行う実験への影響が考えられたため、MEF内におけるspontaneousなマーカー陽転化について十分に検討する必要が生じた。そのため、リプログラミング誘導開始時期に遅れが生じた。また、iPS研究者からの助言で、後述のリプログラミング化度合いのモニタリングに関して、システムの改善を行うこととしたため、そのための時間を要した。
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| Strategy for Future Research Activity |
MEF内におけるspontaneousなマーカー陽転化について検討を要したが、通常培養では陽性細胞の頻度は長期（８週以上）にわたり変化が無いことが十分に確認された。基本的には当初の計画通りに実験を進められる目処が立った。
細部に関しての計画の改善点として、実験協力研究者からの助言で、リプログラミング時のモニタリングに関して、Nanogプロモーター下流に蛍光タンパク質cDNAを配置したマーカーを追加して山中ファクター発現コンストラクト内に設置すると、細胞を生かしたままpluripotencyの最初のスクリーニングが可能となり、リプログラミングの判定を格段に簡便化できることがわかった。そのため、その系を導入する計画を追加した。
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| Causes of Carryover |
実験開始後に、使用実験系に想定外にバックグラウンドを生ずる可能性が判明したため、使用細胞を実験条件に即した環境で長期培養し、検出予定マーカー陽性率の変化などの基礎的条件の確認を行った。また、それに関連してリプログラミング検出の方法をより高感度たん細胞レベルでできるための改良を施しているため、トランスフェクション実験の完了が次年度に持ち越すためそのための費用を次年度使用とした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
トランスフェクション試薬約２本（３ml）分の費用とする予定である。
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