2016 Fiscal Year Research-status Report
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26460378
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| Research Institution | Kumamoto Health Science University |
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Principal Investigator |
矢野 正人 熊本保健科学大学, 保健科学部, 教授 (60315299)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ミトコンドリア / ストレス応答 / 酸化ストレス / ABCB10 / TMEM65 / トランスポーター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでの本研究において、siRNAによりABCB10をノックダウンすることで、酸化ストレス抑制因子（活性酸素種（ROS）の除去に直接的あるいは間接的に関わる因子）の発現量が増加することが明らかになっていた。本年度、実際に細胞内のROSの量を調べたところ、僅かではあるが有意に増加していることがわかった。また、細胞内タンパク質のカルボニル化も僅かではあるが亢進していた（注：タンパク質のカルボニル化はROSの増加により亢進する）。これらのことから、ABCB10のノックダウンにより一時的にROSの産生が亢進するが、それを感知して発現誘導される酸化ストレス抑制因子によって、ROSの多くは除去されると推定された。また、これまでに、ABCB10をノックダウンすると、各種ミトコンドリアストレス応答因子（ミトコンドリア内で働く分子シャペロンやプロテアーゼ等）のmRNA発現量が減少することが確認されていた。このことから、前年度の解析でABCB10がペプチドトランスポーターとして働くことを証明できなかったものの、ABCB10がミトコンドリアストレス情報伝達に何らかの形で関与している可能性が高いと考えられた。なお、ABCB10に関して、これまでの研究結果をまとめBBRC誌にて論文発表した。また、本年度末に、ミトコンドリアストレス応答因子のタンパク質発現量も減少しているか調べた。その結果、各種ミトコンドリアストレス応答因子のうち、LONP1、DNAJA3、YMEL1の発現量が若干ではあるが減少していることがわかった。
一方で、TMEM65については、これまでにノックダウンにより脂質代謝関連因子のmRNA発現量が増加することがわかっていたが、本年度、そのタンパク質発現量も増加しているか調べたところ、顕著に増加していることが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度の研究において、ヒトABCB10をノックダウンした際に、細胞内のROSの量が増加することや、タンパク質のカルボニル化が亢進することが示された。また、これまでに、ABCB10をノックダウンすることで、ROS除去作用を持つ酸化ストレス抑制因子の発現が上昇することが確認されている。これらのことから、ABCB10のノックダウンにより一過性にROSの産生が亢進するが、その後、発現誘導される酸化ストレス抑制因子が、ROSの多くを除去すると推定された。ヒトABCB10は、線虫HAF-1（注：ミトコンドリア内膜においてペプチドトランスポーターとして働き、ミトコンドリア内で分解されてできたペプチドをサイトソルに放出することで、ミトコンドリアストレス情報をミトコンドリア外に伝達する役割を担っていると考えられている）のオルソログであると推定されている。しかし、前年度、ABCB10をノックダウンや過剰発現しても、ミトコンドリアからサイトソル側へのペプチド放出量が有意に変化することを示す結果は得られなかった。一方で、これまでに、ABCB10をノックダウンすると、ミトコンドリアストレス応答因子群のmRNA発現量が低下することが確認されている。これらの結果から、ABCB10は、ペプチド放出以外の何らかの方法で、ミトコンドリアストレス情報伝達に関与していると推定された。なお、これまでの研究結果をまとめBBRC誌で論文発表した。また、本年度、ABCB10のノックダウンによりミトコンドリアストレス応答因子であるLONP1、DNAJA3、YMEL1のタンパク質発現量が若干低下することを示す結果を得た。このように、査読付き論文を発表できたものの、諸般の事情（熊本地震等）により研究全体に若干の遅れが生じたため、総合的に判断して、研究目的達成度の区分は「やや遅れている。」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究結果から、ミトコンドリア内膜タンパク質であるABCB10は、ペプチド放出以外の何らかの方法で、ミトコンドリアストレス情報伝達に関与していると推定された。そこで、平成29年度には、ABCB10が他のタンパク質と相互作用することでミトコンドリアストレス情報伝達を行っている可能性を検討する。具体的には、細胞からミトコンドリアを精製し、ジギトニン等の弱い界面活性化剤を用いてタンパク質複合体を抽出した状態で免疫沈降実験を行い、ABCB10とともに共沈してくるタンパク質を同定する。必要に応じて、FLAGタグ付きABCB10を用いる方法や、ブルーネイティブゲル電気泳動法を用いる方法、ミトコンドリア（あるいは、抽出されたタンパク質複合体）を予め架橋試薬で処理しておく方法などを適宜組み合わせ、ABCB10と相互作用するタンパク質を同定する。その後、同定されたタンパク質が直接的にミトコンドリアストレス情報伝達を担っているかノックダウン法や過剰発現法を用いて調べる。
一方で、ミトコンドリア内膜タンパク質であるTMEM65に関しては、ミトコンドリアストレス情報伝達に関与している可能性は低いが、脂質代謝に関わっている可能性が高いことがわかった。今後、TMEM65がどのようにして脂質代謝に関与しているのかを明らかにするために、ABCB10の場合と同様の方法を用いて解析を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
平成28年1月に親族が逝去し、その後の相続手続きに長期間かかった。また、平成28年4月の熊本地震により、賃貸マンションが損壊し、別のマンションに引っ越す必要が生じた。地震により講義の休講期間が生じ、それをカバーするための補講等を行う必要が生じた。これらの理由のため、実験を行う時間を十分に確保できなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成29年度に繰り越された資金は、「今後の研究の推進方策等」の項で述べた実験を行うために必要な実験用器具類（チューブーローテーター、ダウンス型ホモジナイザーなど）や実験用試薬・消耗品類（一般試薬、架橋試薬、界面活性剤、キムワイプなど）の購入費用や、論文の別刷りの購入費用に充てる予定である。
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