2014 Fiscal Year Research-status Report
生殖腺の性特異的分化に関わる細胞特異的エピジェネティック修飾の時空間的変化
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26460410
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
横山 俊史 神戸大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (10380156)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
星 信彦 神戸大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (10209223)
三木 崇範 香川大学, 医学部, 教授 (30274294)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 性分化 / 真性半陰陽 / 内部標準遺伝子 / Sry / Sox9 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
性逆転症系統遺伝子組換え動物における真性半陰陽個体および野生型個体における性分化関連因子のタンパク質レベルでの時空間的な発現解析を行い，Sryの発現時期の4-5時間程度の遅延が生じていること，雄性化の実行因子であるSox9の発現時期および発現部位がさらに遅延して，キャッチアップされないことを明らかとした．さらにこの発現差には同表現型の中でも差が認められ，今までの研究結果と合わせると，雄性生殖腺の形成程度との相関推測された（発表1，2；投稿中）．さらに，本検討を行う中で真性半陰陽個体の雄性化に，B6亜系統内でも差が存在する可能性が示された．これは，常染色体領域の性分化への関与を示す証拠であるので，新規の所見であるか否かを検討中である．
前述の検討中に性分化関連因子のmRNA発現解析を行ったが，既報の内部標準遺伝子の変動が認められた．そこで性分化開始初期段階から成獣に至るまでの，雌雄個体の各段階で使用可能な内部標準遺伝子の探索を行った．15本の内部標準候補の安定性について複数のアルゴリズムを組み合わせて検討した結果，胎子期から成獣までの雌雄について使用可能な内部標準遺伝子候補を選定することが出来た．加えて，実験条件により適切な内部標準遺伝子が変動することも合わせて解明し，時期特異的な内部標準遺伝子リストを選定した（発表3，4）．
哺乳類における性分化不全とくに左右において異なる表現形を示す機構を解明するため，同じ脊椎動物で特に雌において左右で性腺の発達が異なるある鳥類の性分化機構との比較を行った．その結果，哺乳類と同様に雄性生殖腺の維持に関与するDMRT1の発現は時期特異的また部位特異的に異なっており，一部の支持細胞は従来提唱されている間充織以外から由来することが示唆された（発表5，6，7）
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究の遂行は予定よりやや遅れているが，その原因は前述の今回発見した性分化における遺伝的背景の多様性および，次に示す通り用いる遺伝子組換え動物に由来しており，以下の記載の対策より取り戻すことが可能と考えている．
研究に用いる真性半陰陽個体となる遺伝子型の動物の出現割合が低く，十分量の実験個体を得る事が出来ていない．胎子の両側の性腺における発現量を比較しているため，材料として得られる遺伝子量は極めて少ない．加えて同一遺伝子型より真性半陰陽，半陰陽，雄性，雌性と表現型の異なる個体が得られる実験動物であるが，胎子の段階では将来どの表現型となるのか判別が付かない．
これらの点については，野生型の動物を用いた解析を先行させ，解析を行う群数ならびに関連遺伝子の減少を行っている．この中では研究開始時には想定されていなかった性分化に関する新たな知見が得られている．さらに，エピジェネティック解析についても培養細胞系において検出系の確立を行い，野生型動物の器官培養系を用いたex vivoでの適用を図っている所である．加えて，目的遺伝子組換え動物体の直接的な子孫を得ることが出来たため，この動物が目的とする所見を維持しているかの確認を開始している．この改良は目的産子数を3-4倍に引き上げるため，研究の加速が可能と期待される．
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| Strategy for Future Research Activity |
性分化に関する知見はここ１年でも大きく前進しており，性分化関連因子の発現制御が当初予期していたよりも複雑な因子が関与することに加えて，厳密な時空間的制御を受けることが明らかとなっている．
申請者らの現段階における検討結果でも，野生型個体における性分化関連因子の調節機構の差を認めると共に，その時空間的な制御の複雑さが明らかとなっている．さらに，真性半陰陽個体においては雄性化の実行因子Sox9の発現制御の撹乱が大きな差となって表出しており，これによる機構解明は重要であると考えている．
本年度はこの状況を踏まえ，10.5-11.5日齢を中心に1/12日単位でグループ分けを継続して，性分化関連因子の時空間的な発現解析を行うとともにエピジェネティック修飾の解析を行う．前項（現在までの達成度）で示したように，限られた目的動物を有効に使用するため野生型での系確立後に解析すると共に，器官培養系における多面的な発現撹乱の確立を行うように留意する．発現解析のポイントはSry 発現後のSox9発現の拡大期に絞り，前者はSry調整タンパク因子群を中心とし，後者に対してはFgf9およびFgfr，PtgD2およびそのレセプター類に焦点を当てて，エピジェネティック修飾の関与を明らかにする．
さらに，単なるRNA干渉のみならず，ターゲットとなる修飾配列をゲノム編集で操作することでより直接的な証明が可能であるため，時期特異的な修飾撹乱を行う系の確立を検討する．これらの検討を合わせて行うことで，性分化機構におけるエピジェネティック修飾について大きな知見を得ることが可能であると考えている．
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| Causes of Carryover |
投稿中の論文の掲載費用として計上していたが，修正等の関係で年度内の執行が出来なかった．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
投稿論文を速やかに掲載可能な状態とし，その掲載費用として使用する．
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