胆汁ショットガン・プロテオミクス解析による慢性胆嚢炎からの胆嚢発癌経路の解明

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26460426
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 柳澤 信之 北里大学, 医学部, 講師 (80337914)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 村雲 芳樹 北里大学, 医学部, 教授 (40324438)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 胆嚢発癌 / プロテオミクス / 胆嚢癌 / 胆嚢炎

Outline of Annual Research Achievements

平成26年度までの期間において、種々の胆嚢炎症例（正常コントロールを含む）204例と胆管癌30例、胆嚢癌15例、膵胆管合流異常症5例、胆嚢adenoma4例の胆汁・胆嚢粘膜（31歳～87歳）を収集した。一部の症例については腫瘍部の新鮮凍結材料も採取出来た。解析の中心となる胆嚢癌と、膵胆管合流異常症ついては収集がやや難渋しており、引き続き症例収集を重点的に進めていく予定である。
胆汁サンプルのタンパク抽出調製については、症例間での胆汁の性質（色調・粘調性）にかなりの多様性がみられ、実際にタンパク濃度にも大きく差があった。二次元電気泳動用のサンプルの調製法について、アセトン沈殿法・アセトニトリル沈殿法などを組み合わせ最適化して二次元電気泳動を11例について行った。そのうち1例は4スポットのゲル内消化後MS解析を行ったが、免疫グロブリン断片などであり有意でなかった。また分離の程度が悪くスポット自体も数が少ないため、二次元電気泳動法では解析を進めることが困難と思われた。
従ってLC-MS用の胆汁サンプルの調整法について、最適と思われる方法を検討した。複数回のLC-MS解析結果を１つにまとめ、検出ペプチド数1000以上の例について絞り検討したところ、最終的に正常コントロール4例・胆嚢炎7例・胆石症（炎症なし）2例・胆嚢adenoma1例・膵胆管合流異常症1・胆嚢癌6例（うち4例は２回ずつ解析）、計25例となり、同定した総タンパク数は3762種類となった。そのうち胆嚢癌でのみ検出されたタンパクは42種類（2例以上。3例以上は9種類）、adenomaのみは53種類、膵胆管合流異常症のみは39種類で、胆嚢炎・胆嚢癌で検出されたタンパクは計217種類であった。これらの中で興味深いタンパクを選定しウエスタンブロッティングで発現を確認する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

症例収集にやや難渋している群がある。
LC-MS解析にあたりサンプル調整の最適化に手間取った。
年度内にLC-MS解析装置が故障し、解析が進められなかった期間があった。

Strategy for Future Research Activity

引き続き症例の収集を進めるとともに、LC-MS解析で同定したタンパクの一部について、ウエスタンブロッティングで発現の確認を行う。

Causes of Carryover

LC-MS解析結果がある程度まとまるまで時間がかかり、ウエスタンブロッティングを行うタンパクの選定時期が遅れたため。
ウエスタンブロッティング検出機器について、申請した機器の評判等を考慮し再検討したため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

解析候補タンパクについて、申請した検出機器を平成26年度末に予定通り購入した。ウエスタンブロッティングによる発現解析を平成27年度以降に進める予定である。