胆汁ショットガン・プロテオミクス解析による慢性胆嚢炎からの胆嚢発癌経路の解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26460426
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 柳澤 信之 北里大学, 医学部, 講師 (80337914)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 村雲 芳樹 北里大学, 医学部, 教授 (40324438)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 人体病理学 / 胆嚢発癌 / 慢性胆嚢炎

Outline of Annual Research Achievements

平成27年度までの期間において、種々の胆嚢炎症例（正常コントロールを含む）204例と胆管癌30例、胆嚢癌15例、膵胆管合流異常症5例、胆嚢adenoma4例の胆汁・胆嚢粘膜（31歳～87歳）を収集した。一部の症例については腫瘍部の新鮮凍結材料も採取出来た。解析の中心となる胆嚢癌と、膵胆管合流異常症ついては収集がやや難渋しており、引き続き症例収集を重点的に進めていく予定である。
胆汁サンプルのタンパク抽出調製については、症例間での胆汁の性質（色調・粘調性）にかなりの多様性がみられ、実際にタンパク濃度にも大きく差があった。二次元電気泳動用のサンプルの調製法について、アセトン沈殿法・アセトニトリル沈殿法などを組み合わせ最適化して二次元電気泳動を11例について行った。そのうち1例は4スポットのゲル内消化後MS解析を行ったが、免疫グロブリン断片などであり有意でなかった。また分離の程度が悪くスポット自体も数が少ないため、二次元電気泳動法では解析を進めることが困難と思われた。
従ってLC-MS用の胆汁サンプルの調整法について、最適と思われる方法を検討した。複数回のLC-MS解析結果を１つにまとめ、検出ペプチド数1000以上の例について絞り検討したところ、最終的に正常コントロール4例・胆嚢炎7例・胆石症（炎症なし）2例・胆嚢adenoma1例・膵胆管合流異常症1・胆嚢癌6例（うち4例は２回ずつ解析）、計25例となり、同定した総タンパク数は3762種類となった。そのうち胆嚢癌でのみ検出されたタンパクは42種類（2例以上。3例以上は9種類）、adenomaのみは53種類、膵胆管合流異常症のみは39種類で、胆嚢炎・胆嚢癌で検出されたタンパクは計217種類であった。これらの中で興味深いタンパクの5種類を選定しウエスタンブロッティングで発現確認を試みた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

LC-MS解析で同定したタンパクの検出確認に難渋している。

Strategy for Future Research Activity

タンパクの検出に難渋しているため、タンパク精製法について再検討する。また胆嚢粘膜のパラフィン切片に対し免疫組織化学的検索を同時進行して行う予定である。

Causes of Carryover

タンパク発現の確認が難渋しており、実験方法の見直しが必要であった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

タンパク精製法の再検討のための試薬とタンパク発現確認用に一次抗体の購入を行う。