2015 Fiscal Year Research-status Report
Ｂ細胞リプログラミングとヒト化マウスモデルによるホジキンリンパ腫発症機構の解析
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26460439
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
渡邉 真理子 北里大学, 大学病院, 臨時職員 (90270701)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
堀江 良一 北里大学, 医学部, 准教授 (80229228)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | Hodgkinリンパ腫 / EBウイルス / CD30 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
正常B細胞がリンパ芽球様細胞株（LCL）へトランスフォームする過程で誘導される事を確認したLMP-1、JunB、CD30の発現を複数のLCL、Hodgkinリンパ腫（HL）細胞株、B細胞株においてウエスタン法を用いて検討した。LMP-1、JunB、CD30の発現はLCLで、JunB、CD30の発現はHL細胞株で認め、ERK1/2の活性化を伴なっていた。検討したB細胞株においてはLMP-1、JunB、CD30の発現は認めなかった。
ヒト化マウスからB細胞を分離してシクロスポリンによる免疫抑制下においてEpstain-Barr ウイルス（EBV）を感染させトランスフオーム、LCLを作製した。作製したLCLにレンチウイルスベクターを用いて蛍光蛋白質を発現させた。蛍光蛋白質を発現した細胞はフローサイトメトリーにて分離、発現していない集団はコントロールとして保存した。ヒト化マウス尾静脈から蛍光ラベルしたLCLを注射して、その分布を経時的に蛍光検出機を用いてスキャンして観察した。注射する蛍光ラベルしたLCLの細胞数、蛍光イメージアナライザーの感度に検討を有する事が明らかとなった。この点について条件を検討中である。
正常B細胞がLCLへトランスフォームする過程で、B細胞のリプログラミングを阻害する因子であるABF-1の誘導を認めた。ABF-1の誘導はウエスタンブロットおよびRT-PCR法により確認した。ABF-1の誘導機構解析に向けてそのプロモーターを単離、レポ―タージーンアッセイにより活性誘導に必要な領域を同定した。コンピュータ解析により、この領域に結合しうる転写因子の候補を複数同定する事が出来た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ヒト化マウスへ注射する蛍光ラベルしたLCLの細胞数、蛍光イメージアナライザーの感度に検討を有する事が明らかとなったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒト化マウス実験において、注射する蛍光ラベルしたリンパ芽球様細胞株（LCL）の細胞数、蛍光イメージアナライザーによる検出条件を最適化し、LCLの分布と増殖を観察しつつ、増殖の見られる臓器を中心として解析する。解析はホルマリン固定してパラフィン包埋、薄切して作製した標本をCD30とLMP-1に対する抗体を用いた免疫染色法により行う。これにより腫瘍化の拠点となると考えられるニッチの同定を試みる。さらに上皮細胞、間質細胞、リンパ球などに対する抗体を用いた免疫染色を行い、ニッチを構成する細胞群を解析する。得られた情報は実際の臨床検体を用いた解析により検証を行う。
B細胞の分化に関わる転写因子E2AはHodgkinリンパ腫（HL）において抑制因子であるABF-1の過剰な誘導により抑制されていることが報告されている。ABF-1の誘導を前年度同定したLCLに加え、Hodgkinリンパ腫（HL）細胞株、B細胞株、T細胞株においてウエスタンブロットおよびRT-PCR法により確認する。前年度ABF-1のプロモーターを単離、レポ―タージーンアッセイにより活性誘導に必要な領域を同定、コンピュータ解析により、この領域に結合しうる転写因子の候補を複数同定している。LCL、HL細胞株などを用いて、いずれの転写因子が重要な働きをしているかをレポ―タージーンアッセイやクロマチン免疫沈降法により検討する。
さらに伝染性単核球症患者およびHLの診断に用いられたリンパ節標本の切片を用いて、正常B細胞がLCLへトランスフォームする過程で誘導される事を確認したLMP-1、JunB、CD30、ABF-1の発現およびERK1/2のリン酸化を免疫染色法により検討する。正常扁桃をコントロールとして用いる。
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| Causes of Carryover |
研究は概ね順調に進捗しているが、一部の実験が次年度に繰り越された事、論文投稿が予定よりも送れ、関連費用を繰り越しているため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
実験に使用する物品費と論文投稿関連費用に使用する予定である。
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