2014 Fiscal Year Research-status Report
タイト結合に存在するジスルフィド結合の機能解明：酸化還元センサーとしての可能性
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26460455
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
田中 敏 札幌医科大学, 医学部, 講師 (30374250)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | タイト結合 / redox / ジスルフィド結合 / ユビキチン / thioredoxin |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タイト結合膜蛋白のうち、今回は特にoccludinやtricellulinについて、ジスルフィド結合形成と細胞周囲の酸化還元環境との関連や、細胞内動態への影響を検討するため以下の実験を行った。
1、Occludinやtricellulinについて、FLAGタグやGFPとの融合蛋白を発現するベクターを作成した。またそれぞれについて、細胞外ループにあるシステインを変異させたベクターも作成した。Occludinについては、そのN末近傍に存在するユビキチンE3リガーゼITCH認識部位を変異させたベクターも開発した。
2、ヒト上皮系培養細胞に上記のタグ付加蛋白を発現させた状態で低酸素培養状態に置き、タイト結合蛋白の細胞内分布を蛍光顕微鏡で観測した。低酸素下では全体にoccludin減少が見られ、またoccludinがエンドソームと共局在しているのが観察された。その一方、細胞膜上、特に隣接細胞とのジャンクションにあるoccludinが比較的保たれていることが分かった。細胞表面ビオチン化とウェスタン解析を組み合わせた解析でも同様の結果を得た。
3、occludinの安定性を測定したところ、システイン変異型では野生型に比べ蛋白安定性の低下があり、低酸素の培養ではより不安定なる事が確認された。ユビキチンE3リガーゼITCH認識部位を変異させたoccludinでは安定性が回復し、ユビキチンを介した分解機構の存在が示唆された。なお、occludinのシステイン変異とoccludinのリン酸化には有意な関連性を見出せなかった。
4、共免疫沈降により、occludinとtricellulinとの相互作用を野生型と変異型で測定、比較したが、相互作用の有意な差は見られなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
OccludinとユビキチンE3リガーゼITCHの関連について、以前は予想していなかった興味深いデータが得られている。また蛍光顕微鏡を用いた細胞内局在の検討が進んでいる。しかし、thioredoxin family蛋白に関する検討が十分には進んでいない。全体としておおむね順調に進展していると考えた。
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| Strategy for Future Research Activity |
前述の実験を引き続き行うと共に、以下の実験を行う。
1、他のタイト結合膜蛋白の低酸素下やH2O2存在下での動態を、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡や細胞表面ビオチン化-ウェスタン解析で検討する。同時に、システイン変異型タイト結合膜蛋白でも行い、比較検討する。
2、Occludinとユビキチン化について、ユビキチン化の変化の測定のほか、ユビキチンE3リガーゼITCH のノックダウンや強制発現を行い、蛋白量の変化や細胞内動態を、野生型とシステイン変異型について比較する。
3、タイト結合膜蛋白の相互作用について、claudin-1、claudin-4やJAMについても検討する。
4、Occludinやtricellulinのジスルフィド結合に作用するthioredoxin family蛋白の検出を目指し、共免疫沈降や質量分析を試みると共に、いくつかのthioredoxin family蛋白についてノックダウンを行う。また、thioredoxin family蛋白の酸化還元に作用すると考えられているERO1aのノックダウンや強制発現を用いた解析も検討している。
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