ゲノム編集技術を用いたSOX2発現制御機構の解明

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26460465
• Research Institution: Shimane University
• Principal Investigator: 飯笹 久 島根大学, 医学部, 助教 (80306662)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 金廣 優一 島根大学, 医学部, 助教 (60609197)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 幹細胞 / ゲノム編集

Outline of Annual Research Achievements

CRISPR-Cas9 システムを用いて、ヒトSOX2を標的とする複数のGuide RNAを設計した。設計したGuide RNAとCas9をヒト乳がん細胞株MCF-7に遺伝子導入し、ゲノム編集の有無をT7 endonuclease Assayにより確認した。次ぎに、Cas9の酵素活性部位に変異があるCas9D10Aを用いて、最も効率の良かったGuide RNA及び、その反対側にGuide RNAを設計し、同様にゲノム編集を確認した。ゲノム編集が認められたコンビネーションの標的部位に変異を導入したSOX2-Venus相同組換えベクターを、先のCas9D10A, guide RNAと供にMCF-7に遺伝子導入した。同時に、Cas9及びGuide RNAと相同組換えベクターの遺伝子導入も行った。薬剤選択後、生き残った細胞を蛍光顕微鏡観察し、核内にVenusの発現が認められるクローンのゲノムDNAを抽出し、PCR法により相同組換えを確認した。現在、相同組換えベクターのゲノム他領域への組み込みの有無をサザンブロット法により、更にSOX2 発現量とVenusの蛍光シグナルに相関性があるかを、qRT-PCR 及びウエスタンブロット法により解析中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画よりやや遅れているが、申請者が研究機関を異動し、異動先にて新たに実験系を立ち上げたことを考えると順調に進展していると思われる。

Strategy for Future Research Activity

研究申請書と同様の手法に従い、実験を進める。実験途中にMCF-7で問題が生じる可能性も考え、他の細胞株もゲノム編集によりSOX2遺伝子の改変を行っていく。更に、ゲノム編集技術そのものの精度を高めるために、他遺伝子についても遺伝子改変を行う。

Research Products

• [Journal Article] Clustered microRNAs of the Epstein-Barr virus cooperatively downregulate an epithelial cell-specific metastasis suppressor. (2015)
  • Author(s): Kanda T, Miyata M, Kano M, Kondo S, Yoshizaki T, Iizasa H.
  • Journal Title: Journal of Virology Volume: 89 Pages: 2684-2697
  • DOI: 10.1128/JVI.03189-14
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Epstein-barr virus in gastric carcinoma. (2014)
  • Author(s): Nishikawa J, Yoshiyama H, Iizasa H, Kanehiro Y, Nakamura M, Nishimura J, Saito M, Okamoto T, Sakai K, Suehiro Y, Yamasaki T, Oga A, Yanai H, Sakaida I.
  • Journal Title: Cancers Volume: 6 Pages: 2259-2274
  • DOI: 10.3390/cancers6042259.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] A-to-I RNA editing enzyme ADAR2 regulates malignancy in human pleural mesothelioma. (2015)
  • Author(s): Iizasa H, Kenichiro Sakata, Josephine Galipon, Kojiro Maeda, Soh Ishiguro, Nozomi Sakurai, Hironori Yoshiyama, Kazuyoshi Yanagihara, Takanori Kubo, Yoshimasa Kitagawa, Hideyuki Kawauchi, Ui-Tei Kumiko, Jun-ichi Hmada.
  • Organizer: “RNA editing” Gordon Research Conference.
  • Place of Presentation: Renaissance Tuscany II Ciocco Resort in Lucca, Barga, Italy
  • Year and Date: 2015-03-08 – 2015-03-12
• [Presentation] RNA編集酵素ADAR2は悪性胸膜中皮腫細胞の増殖・運動・浸潤性を制御する. (2014)
  • Author(s): 坂田健一郎、前田浩次郎、櫻井希、梁珊珊、中澤誠多朗、吉山裕規、柳原五吉、久保貴紀、北川善政、川内秀之、浜田淳一、飯笹久.
  • Organizer: 第73回日本癌学会学術集会.
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（横浜）
  • Year and Date: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [Presentation] パラペックル構成因子NonOは、SOX2プロモーター制御を介してがん幹細胞様表現型を抑制する. (2014)
  • Author(s): 飯笹久、梁珊珊、高橋秀尚、廣瀬哲郎、藏滿保宏、中澤誠多朗、中村和行、畠山鎮次、川内秀之、吉山裕規、 浜田淳一
  • Organizer: 第73回日本癌学会学術集会.
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（横浜）
  • Year and Date: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [Presentation] RNA編集酵素ADAR2の発現抑制は悪性中皮腫細胞の増殖・運動・浸潤性を低下させる。 (2014)
  • Author(s): 坂田健一郎、前田浩次郎、櫻井希、梁珊珊、中澤誠多朗、吉山裕規、柳原五吉、久保貴紀、川内秀之、北川善政、浜田淳一、飯笹久.
  • Organizer: 第16回RNAミーティング.
  • Place of Presentation: ウインクアイチ（名古屋）
  • Year and Date: 2014-07-23 – 2014-07-25
• [Presentation] RNA-DNA結合タンパク質NonO は、SOX2プロモーター制御を介して乳癌幹細胞様表現型をコントロールする. (2014)
  • Author(s): 飯笹久、梁珊珊、高橋秀尚、藏滿保宏、廣瀬哲郎、中澤誠多朗、畠山鎮次、川内秀之、吉山裕規、浜田淳一.
  • Organizer: 第16回RNAミーティング.
  • Place of Presentation: ウインクアイチ（名古屋）
  • Year and Date: 2014-07-23 – 2014-07-25
• [Presentation] 遺伝子欠損による上皮細胞の感染性喪失を指標とした EB ウイルス感染機構の解明. (2014)
  • Author(s): 飯笹久、金廣優一、千葉朋希、川内秀之、浅原弘嗣、吉山裕規.
  • Organizer: 第11回EBウイルス研究会.
  • Place of Presentation: 国立感染症研究所(東京)
  • Year and Date: 2014-06-27 – 2014-06-27
• [Book] MicroRNAs and oncogenic human viruses (MicroRNAs: Key Regulators of Oncogenesis). (2014)
  • Author(s): Thirion M, Kanda T, Murakami Y, Ochiya T, Iizasa H.
  • Total Pages: 428
  • Publisher: Springer
• [Remarks] 島根大学医学部微生物免疫学講座（微生物）ホームページ
  • URL: http://yoshiyama-lab.org/