2014 Fiscal Year Research-status Report
タイト結合分子クローディンによる新規上皮分化誘導機構の解明
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26460475
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| Research Institution | Fukushima Medical University |
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Principal Investigator |
冨川 直樹 福島県立医科大学, 医学部, 講師 (80468587)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 幹細胞 / 上皮分化 / シグナル分子 / 細胞間接着分子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度において、最初にSFKsメンバー(Src, Lyn, Fyn, Yes, Hck, Lck, Fgr, Blk)のうち、クローディン－６上皮分化を誘導する分子を同定するため、マウスES細胞並びにマウスF9幹細胞株の上皮分化過程における発現と活性化状態を検討した。その結果、Blk、Src、Hck、Fgrの発現と活性化が確認された。次に、これらの細胞内局在を免疫染色法により検討した結果、これらは成熟した上皮細胞様細胞の細胞間接着部位に局在がみられ、クローディン－６と共局在していることが分かった。更に、HEK293T細胞にクローディン－６とこれら分子を発現させ、免疫沈降法によりクローディン－６との相互作用を検討したところ、BlkとSrcのみがクローディン－６と相互作用することが分かった。この結果を踏まえ、F9:Cldn6細胞においてBlkとSrcのshRNAノックダウンを行ったが、共に50%程度のノックダウン効果であり、クローディン－６による上皮分化誘導に影響が認められなかった。
SFKsの活性化を制御するシグナル分子を探索するため、シグナル伝達分子への網羅的な阻害剤スクリーニングを行った結果、PKAの阻害剤を添加時に、クローディン－６による上皮分化誘導とSFKsの活性化の顕著な阻害が認められた。このことから、PKAがSFKsの活性化を制御することが示唆された。
クローディン－６以外のクローディン分子も上皮分化誘導能を有するかを明らかにするため、各クローディン分子（クローディン－１、２、３、４、５、７、８）を恒常的に発現するF9幹細胞株を樹立した。形態学的観察を行ったところ、クローディン－７発現細胞株において若干の上皮分化が見られた。他のクローディンでは全く認められなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
シグナル分子の同定については、ほぼ達成できたが、BlkとSrcのshRNAノックダウン実験が行えなかった。また、ES細胞や初期胚での検討も行えなかったことから、この評価とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
BlkとSrcの機能解析については、ゲノム編集技術として汎用性が広がっているCRISPR/Cas9システムを用いて、ノックアウトF9幹細胞株を樹立し、解析を行う予定である。また、若干の上皮分化が見られたクローディン－７発現細胞株において、クローディン－６シグナル分子との関連性を検討する。
更に、これらの知見を基に、ES細胞や初期胚、成体幹細胞において、クローディンシグナルが上皮分化を誘導するかを明らかにする。
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| Causes of Carryover |
論文投稿費用としてその他に計上していた費用が、論文投稿を行わなかったため、余剰となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度にて論文投稿を予定しており、使用する計画である。
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