2014 Fiscal Year Research-status Report
蠕虫フマル酸還元酵素の反応機構解析と選択的阻害剤の探索
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26460504
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
坂元 君年 弘前大学, 農学生命科学部, 准教授 (50361465)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 蠕虫 / ミトコンドリア呼吸鎖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
呼吸鎖複合体IIの反応方向制御に重要だと考えられるアミノ酸の活性への影響を調べるため、エキノコックス複合体IIに特異的なAla→Pheのアミノ酸変異をRhodobacter capsulatus複合体IIに導入し、R. capsulatusおよびRhodospirillum rubrumで発現させる。逆に、エキノコックスと同じく当該アミノ酸がPheであるR. rubrumの複合体IIではPhe→Alaの変異を導入し、同じくR. capsulatusおよびR. rubrumで発現させることを計画した。
R. rubrum複合体IIの野生型とPhe→Ala変異体をR. capsulatusで発現させた場合、R. capsulatusの野生株と比較して、どちらも同程度の増殖速度の低下を招いた。その発現株から得られた細胞膜でのコハク酸ーユビキノン還元活性(SQR活性)も同程度であり、SQR活性には変異がほとんど影響を与えないことが分かった。R. capsulatus複合体IIの野生型をR. rubrumで発現させると、呼吸での増殖速度に変化は無かったが、キノールーフマル酸還元活性(QFR活性)が必要だと予想される光合成ではゆっくり増殖する場合と増殖しない場合があり、サプレッサー変異が関与している可能性もあるが、増殖に不利であることは明らかであった。
エキノコックス複合体IIとR. rubrum複合体IIのキメラ酵素については複数の発現用人工オペロンを用意し、R. capsulatusでの発現を試みているが、これまでのところ目的タンパク質の発現は確認できない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
単純なアミノ酸変異導入であるため、特に工夫が必要ないと考えていたが、変異を持つプラスミドの構築に難航している。各実験操作を精査することで現在は進行中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
R. rubrumにR. capsulatus複合体IIを導入した株の光合成での増殖不全が複合体IIの反応性によるものか、発現量によるものかを明らかにするために、変異体のみならず、プロモーター領域をR. rubrumの複合体IIプロモーターに置き換えた株も用意し、問題点を明らかにする。
ミトコンドリア複合体IIのアッセンブリーファクターが１，２に続き、３，４の存在が報告されたため、エキノコックスのこれら遺伝子をクローニングし、発現ベクターに組み込む。
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| Causes of Carryover |
目的の変異体の作製の遅れが生じたため、培養等で必要な消耗品の利用が予定より少なかった。また、同じ理由で学会発表の旅費を必要としなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
研究計画の遅れを取り戻すと、大量培養と多くの活性測定が必要になる。活性測定を円滑に進めるために分光光度計の購入を計画している。
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