2015 Fiscal Year Research-status Report
シングルタグ・ハイブリダイゼーション法を活用したマラリア遺伝子検査ツールの開発
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26460514
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| Research Institution | Dokkyo Medical University |
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Principal Investigator |
川合 覚 獨協医科大学, 医学部, 准教授 (70275733)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川瀬 三雄 東北大学, その他の研究科, 教授 (50108057)
美田 敏宏 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80318013)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ＳＴＨ法 / クロマトPAS法 / マラリア / 鑑別診断 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、シングルタグ・ハイブリダイゼーション法（STH法）とクロマトPAS（Printed Array-Strip）を組み合わせた検査技術を用いて、マラリアの新たな遺伝子検査ツールの開発を目指している。本研究の目標は5種類のマラリア原虫を1本の検出ストリップ上で同時に同定する検査ツールを確立することである。平成26年度の研究ではPlasmodium属・ミトコンドリアDNAのCytochrom ｂ を標的遺伝子としたプライマーを設計し、各種マラリア原虫の鑑別を試みた。平成27年度は原虫鑑別の特異度を上げる目的で、18s SSUrRNA gene を標的遺伝子とした新たなプライマーを設計し、STH－クロマトPASを試みた。今回は全種共通の領域でForward primer を設計し、種特異的な領域でReverse primerを設計した。Forward primerにはビオチン標識を施し、各Reverse primerには以下のようなシングルタグを標識した：Universal (B1), P. falciparum (B2), P. vivax (B4), P. malariae (B5), P. ovale (B7), P. knowlesi (B8)。本研究ではB8タイプのストリップを用いて、(B1)にgenus Plasmodium、 (B2)にP. falciparum、 (B4)にP. vivax、 (B5)にP. malariae、 (B7)にP. ovale、 (B8)にP. knowlesi が検出されるように設定した。PCRはP. yoeliiおよび５種のヒトマラリア原虫から精製したgenomic DNAをテンプレートとして用い、増幅産物をSTH-PAS法でクロマト展開した。その結果、各原虫種ともに、設定どおりの位置にバンドが検出された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画に準じ、おおむね順調に進展した。今年度は全種共通の遺伝子領域でForward primer を設計したことにより、PCR時のプライマー数が少なくなったため、プライマーダイマーの形成が抑制された。また、前年度のCytochrom ｂ を標的遺伝子としたプライマーセットに比較して、検出の種特異性が増加した。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度に設計したプライマーにより、検出の種特異性は増加したが、検出感度については検討できなかった。したがって次年度は、各種原虫の標的領域の合成遺伝子を作成し、各種プライマーセットの検出感度を明らかにする予定である。また当初、計画していた、熱帯熱マラリア原虫の薬剤耐性に関わる遺伝子変異領域の検出については、着手できなかった。次年度は熱帯熱マラリア原虫の遺伝子変異領域の検出についても、視野に入れた実験を展開したいと考えている。
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| Causes of Carryover |
今年度は新たなプライマーセットを設計し、実験に供試した。これらのプライマーセットの検出感度を検討する目的で、標的領域の合成遺伝子を発注する予定であったが、実験の遅れにより、発注には至らなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成２７年度に設計したプライマーセットの検出感度を検討する目的で、標的領域の合成遺伝子を作製するために経費を使用する計画である。
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Research Products
(2 results)
