シングルタグ・ハイブリダイゼーション法を活用したマラリア遺伝子検査ツールの開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26460514
• Research Institution: Dokkyo Medical University
• Principal Investigator: 川合 覚 獨協医科大学, 医学部, 准教授 (70275733)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川瀬 三雄 東北大学, 医工学研究科, 教授 (50108057) ; 美田 敏宏 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80318013)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: STH法 / クロマトPAS / マラリア / Plasmodium / 18s SSUrRNA / Cytochrom ｂ

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、シングルタグ・ハイブリダイゼーション法（STH法）とクロマトPAS（Printed Array-Strip）を組み合わせた手技により、マラリアの新たな遺伝子検査ツールの開発を目指している。平成26年度の研究ではPlasmodium属・ミトコンドリアDNAのCytochrom　ｂ geneを、そして平成27年度は18s SSUrRNA gene を標的遺伝子としたプライマーを設計し、各種マラリア原虫の鑑別を試みた。両プライマーともにForward primerにはビオチン標識を施し、各Reverse primerには以下のようなシングルタグを標識した：Universal (B1), P. falciparum (B2), P. vivax (B4), P. malariae (B5), P. ovale (B7), P. knowlesi (B8)。本研究ではB8タイプのストリップを用いて、(B1)にgenus Plasmodium、 (B2)にP. falciparum、 (B4)にP. vivax、 (B5)にP. malariae、 (B7)にP. ovale、 (B8)にP. knowlesi が検出されるように設定した。その結果、両プライマーともに設定どおりの位置に陽性バンドが検出された。平成28年度は標的遺伝子をCytochrom　ｂ geneと決定し、混合感染を想定した実験を試みた。その結果、2種類の原虫ｇDNAを混合させた場合は、設定どおりの位置に明瞭な2本の陽性バンドを検出することができた。しかしながら、3種類以上の場合は、非特異反応の出現や、本来出現する陽性バンドの消失が生じた。したがって、現行のSTH－クロマトPASでは、１～２種類のマラリア原虫種であれば同定可能であるが、3種類以上になると不具合が生じるため、さらなる条件検討が必要であった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

これまで、標的遺伝子として２つの領域（Cytochrom　ｂ gene、18s SSUrRNA gene）のPCR増幅産物を比較検討した。両者ともに設定どおりの位置に陽性バンドが検出されたが、検出感度としてはCytochrom　ｂ geneの方が高感度であった。また、混合感染を想定した実験では２種類の混合であれば同定可能であるが、3種類以上になると非特異反応等の不具合が生じた。したがって、当初5種類のマラリア原虫を1本の検出ストリップ上で同時に同定することを目標としていたので、本研究の平成28年度終了時点における達成度は7割程度と考えられる。

Strategy for Future Research Activity

STHクロマトPAS法における有益性は、1本の検出ストリップ上で同時に数種類の病原体を鑑別できる点にある。現在の方法では、マラリア原虫種が3種類以上になると不具合が生じることから、プライマー配列の詳細な検討や、PCR時のバッファー、マグネシウム濃度、増幅サイクル数、増幅温度等の再検討が必要と考えられる。したがって、本研究で得られた基礎データをもとにプライマーを再構築し、PCR条件の改良を重ねたいと考えている。

Causes of Carryover

新規プライマーおよびPCR条件の再検討が必要となったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

新規プライマーの作製、標的遺伝子の合成DNAの作製。