Development of a multiplex STH-PAS assay as a tool for malaria diagnosis.

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26460514
• Research Institution: Dokkyo Medical University
• Principal Investigator: 川合 覚 獨協医科大学, 医学部, 教授 (70275733)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川瀬 三雄 東北大学, 医工学研究科, 教授 (50108057) ; 美田 敏宏 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80318013)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: STH法 / クロマトPAS / マラリア / Plasmodium属 / 混合感染

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、シングルタグ・ハイブリダイゼーション法（STH法）とクロマトPAS（Printed Array-Strip）を組み合わせた手技により、マラリアの新たな遺伝子検査ツールの開発を目指している。平成26年度の研究ではPlasmodium属・ミトコンドリアDNAのCytochrom　ｂ geneを、そして平成27年度は18s SSUrRNA gene を標的遺伝子としたプライマーを設計し、各種マラリア原虫の鑑別を試みた。両プライマーともにForward primerにはビオチン標識を施し、各Reverse primerには以下のようなシングルタグを標識した：Universal (B1), P. falciparum (B2), P. vivax (B4), P. malariae (B5), P. ovale (B7), P. knowlesi (B8)。本研究ではB8タイプのストリップを用いて、(B1)にgenus Plasmodium、 (B2)にP. falciparum、 (B4)にP. vivax、 (B5)にP. malariae、 (B7)にP. ovale、 (B8)にP. knowlesi が検出されるように設定した。その結果、両プライマーともに設定どおりの位置に陽性バンドが検出された。平成28年度は標的遺伝子をCytochrom　ｂ geneに変更し、混合感染を想定した実験を試みた。その結果、2種類の原虫ｇDNAを混合させたサンプルでは、設定どおりの位置に明瞭な2本の陽性バンドを検出することができた。しかし3種類以上になると、非特異反応の出現や、本来出現する陽性バンドの消失が生じた。そこで、平成29年度はプライマーの再構築や、PCR時のバッファー、マグネシウム濃度、増幅サイクル数、増幅温度等の再検討を行ったが、特に改善は認められなかった。