2014 Fiscal Year Research-status Report
インフルエンザ菌の気道上皮細胞内寄生と細胞傷害性T細胞応答の解析
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26460521
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
永田 年 浜松医科大学, 医学部, 教授 (90275024)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
榎本 紀之 浜松医科大学, 医学部, 講師 (50436961)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | インフルエンザ菌 / 気道上皮細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
NTHiの気道上皮内侵入・寄生および再活性化機構の解明
NTHiの気道上皮細胞内寄生の確認をおこなった。
NTHiの気道上皮細胞内に侵入することをヒト気道上皮細胞株であるBEAS-2B細胞株を用いて確認した。NTHi菌株として、ATCC保存株2種（ATCC19418, NCTC8143）および浜松医科大学附属病院臨床分離株数種 (HUSM0195, HUSM0481他)を用いた。NTHi菌株をLIVE/DEAD BacLight細菌染色キット (Molecular Probes社)を用い生きたまま染色した後、BEAS-2B細胞に感染させその局在を経時的に、蛍光顕微鏡 (BIOREVO BZ-9000; Keyence社)を用いて観察した。NTHi菌の細胞内局在を確認するため、感染細胞の食胞（ファゴゾーム）をLysoTracker試薬 (Molecular Probes社)を用いて染色した。細胞内の生存細菌数は、NTHi感染細胞を回収しそれをチョコレート寒天平板培地にプレーティングすること（平板プレート法）により計測した。NTHiを感染後、細胞外の細菌は細胞内浸透生のない抗菌薬であるゲンタマイシンで殺菌した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
NTHi菌株 (ATCC19418, HUSM0195, HUSM0481) が、BEAS-2B細胞内に侵入することを確認した。その細胞内侵入のメカニズムについて検討した。ビトロネクチンが、NTHiの細胞表面への付着、細胞内侵入に関与していることを確認するため、プラスチックプレートにコートしたビトロネクチンにNTHiが付着するか検討した。その結果、NTHiは、ビトロネクチンに付着することを確認した。この付着はNTHiのプロテインEの84-108番目のアミノ酸からなるペプチド (PE84-108) の全処理で阻害された。この阻害の程度はPE84-108ペプチドの濃度依存的であった。同様に、NTHiのBEAS-2B細胞内への侵入も、PE84-108ペプチドの濃度依存的に阻害された。このことから、NTHiの気道上皮細胞への侵入は、宿主のビトロネクチン、NTHiのプロテインEが関与した過程であることが明らかとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在進めている、NTHiの気道上皮細胞への付着、細胞内侵入のメカニズムをより詳細に検討したい。その結果を論文としてまとめる。またNTHiの気道上皮細胞侵入後の局在や細胞内生存期間の確認、あるいは気道上皮内NTHiの再活性化（細胞外への放出）についても検討したい。
さらにNTHiの細胞表面タンパクであるP6遺伝子、P6ペプチドを調製し、マウスを用いて、P6抗原に対する免疫応答、特に細胞傷害性T細胞 (CTL)の誘導について検討していく予定である。
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| Causes of Carryover |
平成26年度の実験試薬は主に既存のものを使用したためその経費があまりかかっていない。その分を、研究に必須の機器である-80°C冷凍庫の調子が悪かったため、新規購入に充てた。平成27年度は、上記の実験を行うために、実験試薬等の購入に研究費を充てる予定である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成27年度は、研究費を以下のものの購入に充てる予定である。細菌・細胞培養器財、培地等、実験用器財（プラスチック器具等）、ペプチドの合成費、学会旅費、論文校正費。
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