Structure-function analysis of bacterial toxins in tissue destruction to apply their functional domains to regenerative medicine

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26460527
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 松下 治 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (00209537)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 内田 健太郎 北里大学, 医学部, 講師 (50547578) ; 美間 健彦 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (80596437)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 細菌毒素 / コラーゲン結合ドメイン / 細胞外マトリックス / 膠原線維 / アンカリング / 骨新生 / 再生医療 / 技術移転

Outline of Annual Research Achievements

Clostridium属細菌のコラゲナーゼのC末端にはPKDドメイン(PKD)とコラーゲン結合ドメイン(CBD)が存在する。本領域を用いて塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)をコラーゲン基剤にアンカリングし、骨新生を誘導する複合剤を開発した。新たに量産可能となったコラーゲン様ペプチドポリマー[(Pro-Hyp-Gly)10]3nを基剤とし、種々のコラーゲン・アンカーを融合したbFGFを添加し、マウス骨折モデルを用いて、これらの複合剤の骨新生誘導能を測定したところ、クラスI酵素(ColG)由来のCBD二量体を用いた場合に最も高い骨新生誘導能が認められた。
本年度は、まず、表面プラズモン共鳴法を用いてin vitroにおける各種アンカーの基剤への結合能を定量した。複数ドメインからなるアンカーが結合するよう長鎖のコラーゲン様ペプチドを用いて結合定数を測定したところ、確かにColG由来のアンカーはクラスII酵素(ColH)由来のものより強い結合能を示したが、一量体と二量体の結合能に有意な差は認められなかった。vitroとvivoの一見矛盾する結果を解明するため、ColG由来CBD二量体の構造をX線結晶学的に決定するとともに、水溶液中の構造をX線小角散乱法により決定したところ、二量体の基質結合部位は互いに異なる方向を向いていることが明らかになった。加えて、二量体は少量でコラーゲンのゲル化を促進したことから、二量体は一つのトロポコラーゲン分子に結合するのではなく、二つのトロポコラーゲン分子に結合することが明らかとなった。以上の研究から基質アンカリングにおけるCBD二量体の意義を統一的に理解することができた。橋渡し研究の成果は米国で仮特許出願(62/457,410)を行うとともに、基礎研究の成果の投稿準備を進めている。

Research Products

• [Int'l Joint Research] アーカンソー大学(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: アーカンソー大学
• [Journal Article] Oriented collagen tubes combined with basic fibroblast growth factor promote peripheral nerve regeneration in a 15 mm sciatic nerve defect rat model. (2017)
  • Author(s): Fujimaki H, Uchida K, Inoue G, Miyagi M, Nemoto N, Saku T, Isobe Y, Inage K, Matsushita O, Yagishita S, Sato J, Takano S, Sakuma Y, Ohtori S, Takahashi K, Takaso M.
  • Journal Title: J Biomed Mater Res A. Volume: 105 Pages: 8-14
  • DOI: 10.1002/jbm.a.35866.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Effect of freeze-dried allograft bone with human basic fibroblast growth factor containing a collagen-binding domain from Clostridium histolyticum collagenase on bone formation after lumbar posterolateral fusion surgery in rats. (2017)
  • Author(s): Inoue G, Uchida K, Matsushita O, Fujimaki H, Saito W, Miyagi M, Sekiguchi H, Nishi N, Ohtori S, Yogoro M, Takaso M.
  • Journal Title: Spine Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1097/BRS.0000000000002074.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Acceleration of bone formation during fracture healing by poly(Pro-Hyp-Gly)10 and basic fibroblast growth factor containing polycystic kidney disease and collagen-binding domains from Clostridium histolyticum collagenase. (2016)
  • Author(s): Sekiguchi H, Uchida K, Inoue G, Matsushita O, Saito W, Aikawa J, Tanaka K, Fujimaki H, Miyagi M, Takaso M.
  • Journal Title: J Biomed Mater Res A. Volume: 104 Pages: 1372-1378
  • DOI: 10.1002/jbm.a.35670.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Structural analysis of a matrix anchor in bacterial collagenase to develop a therapeutic to induce osteogenesis. (2017)
  • Author(s): Osamu Matsushita, Kentaro Uchida, Hiroyuki Sekiguchi, Takehiko Mima, Kazuyoshi Goto, Yumiko Yamamoto, Kenji Yokota, Masashi Takaso, Ryan Bauer, Joshua Sakon
  • Organizer: 第90回日本細菌学会総会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（宮城県仙台市）
  • Year and Date: 2017-03-19 – 2017-03-21
• [Remarks] 岡山大学 大学院医歯薬学総合研究科 病原細菌学分野
  • URL: http://www.okayama-u.ac.jp/user/saikin
• [Remarks] Okayama U. Grad. School of Med., Dept. Overview
  • URL: http://www.hsc.okayama-u.ac.jp/mdps/e_side_552.html
• [Patent(Industrial Property Rights)] Collagen-binding agent compositions and methods of using same (2017)
  • Inventor(s): O Matsushita, K Uchida, J Sakon他
  • Industrial Property Rights Holder: U Arkansas, Kitasato U.
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: US 62/457,410
  • Filing Date: 2017-02-10
  • Overseas
• [Patent(Industrial Property Rights)] コラーゲン結合領域と副甲状腺ホルモンとの融合タンパク (2015)
  • Inventor(s): 松下 治、サコン ジョシュア他
  • Industrial Property Rights Holder: アーカンソー大学、香川大学、オクスナー クリニック
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 第5989876号
  • Filing Date: 2015-09-03
  • Acquisition Date: 2016-09-07
• [Patent(Industrial Property Rights)] Fusion proteins of collagen-binding domain and parathyroid hormone (2015)
  • Inventor(s): J Sakon, O Matsushita他
  • Industrial Property Rights Holder: Ochsner, Kagawa U, U Arkansas
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: US 9,528,099
  • Filing Date: 2015-06-18
  • Acquisition Date: 2016-12-27
  • Overseas