2016 Fiscal Year Research-status Report
マダニ媒介性新興感染症起因の難培養性アナプラズマ科細菌を標的としたメタゲノム解析
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26460532
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| Research Institution | University of Shizuoka |
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Principal Investigator |
大橋 典男 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 教授 (10169039)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉川 悠子 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 助教 (00580523)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 細菌 / ゲノム / 新興感染症 / Anaplasma / マダニ媒介性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アナプラズマ科細菌には、マダニ媒介新興感染症の「アナプラズマ症」の病原体であるAnaplasma phagocytophilumなどが含まれる。日本国内では、この細菌が未だに分離されていないため、その知見が乏しい。そこで、本研究では、難培養性A. phagocytophilumに感染した媒介マダニなどの検体を用いて、メタゲノム解析を駆使することにより、この細菌の全ゲノム配列の解読を進めている。我々は、これまでに、A. phagocytophilum感染シュルツェマダニの唾液腺のDNAを用いて、次世代シーケンサーで約900万リードを獲得し、このリードを米国ヒト分離株ゲノムのリファレンス配列にマッピングして、大まかなドラフトゲノム配列の作成に成功した。当該年度は、さらに詳細に解析を進めるため、約4,700万リードを獲得し、de novo assembleにより、total contig sizeが3Mbの細菌群のゲノム配列を得た。これらのcontigsにはA. phagocytophilum以外のも含まれるため、metablast解析を行い、A. phagocytophilumのcontigsを抽出した。得られたA. phagocytophilumのcontigs数は約200個で、予測されるgenome sizeは約1.4Mbであった。また、それ以外のcontigsで、A. phagocytophilumより約10倍多い細菌の配列の存在が明らかとなった。これらの配列は、A. phagocytophilum のGC%とは異なり、さらにblast検索でも高い相同性の配列が見られないことから、これまで未知であったシュルツェマダニのsymbiontのゲノム配列の可能性が高く、このsymbiontは新種と考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
おおむね順調に進んでいる。当該年度は、これまで得られたA. phagocytophilumの大まかなドラフトゲノム配列について、さらに精度の高いゲノム配列の取得を主な目的とした。そのためには、次世代シーケンサーによるさらなるリード数の獲得が必要であった。そして、解析を進めた結果、約4,700万リードを獲得し、in silico解析により、マダニ配列を除去後、細菌群の配列を詳細に精査し、それらの配列のde novo assembleを行った。その結果、細菌群のゲノム配列と思われる約600個のcontigsが得られ、そのtotal contig sizeは約3Mbであった。これらのcontigsにはA. phagocytophilum以外のものが含まれるため、各contigのGC%などを比較した後、metablast解析を行い、A. phagocytophilumの配列を抽出した。その結果、A. phagocytophilumと思われるcontigsが約200個得られ、その予測される genome sizeは約1.4Mbであることが判った。また、それ以外のcontigsの中にはA. phagocytophilumの配列よりも約10倍多い細菌の配列が存在していることも判った。これらの配列は、A. phagocytophilum のGC%とは異なり、さらにblastpやblastnの検索でも高い相同性の配列が見られず、未知の細菌のものであった。実は、マダニには共生細菌（symbiont）の存在が知られているが、シュルツェマダニ（Ixodes persulcatus）の共生細菌のゲノム情報は全く得られていない。よって、この未知の細菌がそのsymbiontであると推察され、おそらく新種であると思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、マダニ唾液腺中から得られた国内のA. phagocytophilumのcontigsからコンプリートゲノム配列の構築を目指して解析を進めている。これまでは、ギャップクローズのために、メイトペアライブラリーを用いた次世代シーケンス解析を試みできたが、宿主マダニの配列が多すぎるため、十分な情報が得られなかった。そこで、現在、最近注目されている安価なLong read sequence法の検討を進めている。この方法は、数十kbのreads（total 20 Gbまで）を得ることができる。これにより、これまでのA. phagocytophilum のcontigs間の多くのギャップがかなり埋まり、contig数が大幅に減少するものと考えられる。また、このLong read sequence法を用いることで、A. phagocytophilumのみならず、新種と思われるシュルツェマダニの共生細菌（symbiont）のゲノム配列もコンプリートできることが期待される。特に、symbiontのゲノム配列は、データベース上にリファレンス配列が存在しないため、de novo assembleでコンプリートしなければならない。よって、このLong read sequence法は極めて有効的であると考える。さらに、このLong read sequence法は、A. phagocytophilum以外の難培養性アナプラズマ科細菌のNeoehrlichia mikurensisのゲノム情報の取得についても応用可能と思われ、その検討を進めている。このようにして、次世代や新世代のシーケンス解析法を駆使し、国内初のA. phagocytophilumや新種のsymbiontなどの全ゲノム配列を解明したい。
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| Causes of Carryover |
本研究は、アナプラズマ症の病原体である難培養性Anaplasma phagocytophilumを保有するマダニのgenomic DNAを用いて、メタゲノム解析により、A. phagocytophilumの全ゲノム配列を解読することが目的である。これまでに感染マダニのDNAからA. phagocytophilumの大まかなドラフトゲノム配列を得ているが、宿主マダニのDNAの混在が多く、ギャップクローズの方法に改善が必要であった。つい最近、安価で高性能なLong read sequence（LRS）法が活用できるようになり、これにより、ギャップクローズを容易にする可能性がでてきた。したがって、本研究を次年度まで延長し、このLRS方法により、A. phagocytophilumの全ゲノム配列の解読を進める予定である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度繰越し予算は、最近注目されている安価で高性能なLong read sequence (LRS)法の試薬などの消耗品購入の経費などに充てる。このLRS方法は、高額な機器を必要とせず、試薬等を含めた消耗品レベルの比較的安価なキットで、数十kbのreads（total 20 Gbまで）を得ることができる。これにより、これまでのA. phagocytophilum のcontigs間の多くのギャップがかなり埋まり、contig数が大幅に減少するものと考えられる。また、A. phagocytophilumのみならず、新種と思われるシュルツェマダニの共生細菌（symbiont）の全ゲノム配列も解読できることが期待される。このようにして、次世代や新世代のシーケンス解析法を駆使し、国内初のA. phagocytophilumや新種のsymbiontなどの全ゲノム配列の解読に努めたい。
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[Presentation] アナプラズマ症2017
Author(s)
大橋典男
Organizer
第90回日本細菌学会総会 （シンポジウム）
Place of Presentation
仙台
Year and Date
2017-03-19 – 2017-03-21
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