集団食中毒事例で検出された新規Stx2ファージの機能解析と疫学研究

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26460544
• Research Institution: Toyama Institute of Health
• Principal Investigator: 綿引 正則 富山県衛生研究所, その他部局等, その他 (20372104)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: Ⅱ型制限修飾酵素遺伝子 / Stx2ファージ / Stx2プロファージ / 集団食中毒 / ファージ疫学

Outline of Annual Research Achievements

今年度は、Ⅱ型制限修飾遺伝子を保有しているStx2溶原菌から、制限(R, restriction)修飾(M, modification)遺伝子のノックアウト株を作製するため、市販のキットを用いて、作成の準備を行った。しかし、本研究では、制限修飾遺伝子をノックアウトした溶原菌あるいは、RM遺伝子のノックアウトStx2ファージを作製し、RM遺伝子の毒素産生性への効果について調べることが目的であり、主な効果の測定は、2つ以上の細菌を混合したときの培地中の毒素産生性を調べるため、現在、本研究の組換え実験は、大臣確認が必要とのことで現在、手続き中である。
一方で、作製したノックアウト株と混合培養する株の選別を目的として、本食中毒事例で分離されたStxファージの特徴の解析を試みた。本食中毒事例では患者消化管内でO111とO157株のStx2ファージの交差感染が強く疑われており、分離された血清群O157株は、同一集団発生株でありながら、遺伝子型別やStx遺伝子の保有パターンについて、多様な分離株が検出されている。従って、本食中毒事例に関連したStx2ファージの特徴を明らかにするため、血清群O111及びO157株の複数株から、Stxファージの分離を試み、非病原性大腸菌C600株を用いて、溶原菌作製を試みたが、分離することはできなかった。唯一、ある患者から分離したO111stx2株から分離したStx2ファージを用いたとき、大腸菌C600で溶原菌が成立し、安定に継代することができた。現在、このようなファージの特徴をStx2プロファージの塩基配列から解析中である。
また、Stx2ファージの疫学データを得る目的で、食品検体等からStx2ファージ検出を試みたが、ファージの存在を示すプラークを検出したが、Stx2ファージの検出には成功していない。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

50%
Ⅱ型制限酵素のノックアウト株あるいはⅡ型制限酵素および修飾酵素のダブルノックアウト株は未だ得られていない。
理由
Ⅱ型制限修飾酵素遺伝子のノックアウト実験は、病原細菌を用いた遺伝子組換え実験を実施するため、大臣確認申請が必要であり、手続き等により若干遅れており、実際の実験が遅れている状況である。

Strategy for Future Research Activity

遺伝子組換え実験の大臣確認実験として申請手続き中である。制限修飾遺伝子のノックアウト株作製を本格的にスタートさせ、本研究の目的である実験をスタートする予定である。
ノックアウト株を用いたⅡ型制限修飾遺伝子の食中毒事例での重症化要因となるかどうかの確認を、毒素産生性により判断することが必要である。そのためのアッセイ系として、Ⅱ型制限修飾遺伝子を保有しないStx2ファージの溶原菌を分離することが必要と考えられ、引き続き分離を試みる。