Functional analysis and epidemiological survey of a novel Stx2 phage isolated from the food-poisoning outbreak

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26460544
• Research Institution: Toyama Institute of Health
• Principal Investigator: 綿引 正則 富山県衛生研究所, 細菌部, 部長 (20372104)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 腸管出血性大腸菌食中毒 / Stx2プロファージ / Ⅱ型制限修飾遺伝子 / 毒素産生

Outline of Annual Research Achievements

今年度は、Ⅱ型制限修飾酵素遺伝子を保有するStx2ファージ中の制限修飾酵素のノックアウト株の作製を行い、特に制限酵素活性が毒素産生に及ぼす影響を調べた。このStx2ファージは、2011年の集団食中毒事例において、患者便および分離株のマイトマイシンC処理後の培養上清からプラーク形成能をもつファージとして回収されたことから、患者腸管内で、ファージ粒子として放出され、感染可能な腸管内細菌叢に存在する大腸菌等に再感染することにより、毒素産生量に影響していることが予想された。
ノックアウト株の作製には、目的遺伝子を破壊するTargeTron Gene Knockout Systemを使用した。その結果、Stx2ファージゲノム中の制限酵素遺伝子の破壊したR（-）株の作製に成功した。尚、制限酵素の破壊については、塩基配列決定により確認した。
制限酵素の効果を検討する実験については、2つのEHECを混ぜる混合実験では、その差を観察することが出来なかった。そこで、R(+)とR(-)のStx2ファージを分離して、C600株に感染させるというシンプルな系を用いてR(+)効果を調べた。そして、RPLAによる毒素産生量の測定したところ、制限酵素の野生型ファージについて、ノックアウト株と比較して2～3菅の毒素産生量が多いことが観察された。これは、大腸菌内では、ファージ感染の初期に制限酵素が産生されて、ホストゲノムDNAに傷を入れ、宿主のSOS反応を誘導した結果、毒素量産生が上昇したと考えられた。
以上の結果から、2011年の集団食中毒事例で、複数の重症患者から、EHECO111およびEHECO157が分離されているが、このStx2ファージの誘導、ファージ粒子の放出及び再感染サイクルが起こり、Stx2毒素量が通常のEHEC感染によるよりも多く産生されることが示唆された。