2014 Fiscal Year Research-status Report
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26460574
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
熱海 徹 北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 研究員 (80360478)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
上村 大輔 北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 助教 (20391922)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 炎症 / DNAメチル化 / スプライシング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究はRNA結合タンパクであるRBM10の非免疫細胞におけるNFkBシグナルとSTAT3シグナルの同時活性化による炎症性サイトカイン、ケモカインの産生増強機構「炎症アンプ」における役割を明らかにするものである。shRNAによるRBM10欠損細胞株では炎症アンプの活性化による炎症性サイトカイン、ケモカインの産生、転写が強く抑制されていた。細胞内シグナル伝達経路の解析ではRBM10は転写因子ｐ65、STAT3のリン酸化、核移行の細胞質内で起こる現象に変化は見られなかった。一方、核内ではｐ65のプロモーターDNAへの会合が顕著に抑制され、ヒストンアセチル化分子ｐ300、ヒストンH3K27のアセチル化、H3K4のトリメチル化も同様に抑制されていたことからRBM10はエピジェネティックな機構により炎症アンプを制御していることが示唆された。またDNAのメチル化についても検討を行い、定常状態におけるCxcl1 遺伝子のｐ65結合配列近傍のシトシンがRBM10欠損細胞株で顕著にメチル化されていることを発見した。さらにメチル化DNA特異的ゲノムワイドシークエンス（MeDIP-sequence）を行い複数の炎症アンプ標的遺伝子の転写開始点付近のDNAメチル化が亢進していることがわかった。De novo DNAメチル酵素であるDnmt3bは選択性スプライシングによって8種類のmRNAが転写されるが、RBM10欠損細胞株ではスプライシングの欠損が認められたことから、RBM10はDnmt3bのDNAメチル化活性に影響を与え、DNAのメチル化を促進していることが示唆された。さらにshRNA抵抗性のRBM10変異体を遺伝子導入することにより、レスキュー実験を行ったところIL-6、ケモカインの産生、転写、DNAのメチル化、Dnmt3bのスプライシングの一連の異常の回復が確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現時点ではRBM10が炎症アンプに関与することが確認でき、RBMノックダウン細胞における炎症アンプの減少はプロモーター領域のｐ65の会合の減少に起因すること、その原因がDNAメチル化の亢進によることを明らかにできた。さらに、制御機構としてRBM10がDnmt3bの選択的スプライシングを制御し、Dnmt3bのメチル化活性を上昇させている可能性を示すことができた。またレスキュー実験によりIL-6、ケモカイン産生の回復、プロモーター領域のDNAメチル化の低下、活性型Dnmt3bアイソフォームの存在比の減少が確認できた。計画時点ではRBM10のスプライシング活性とは異なった機構で炎症アンプの制御に関係していると想定していたが、RBM10のスプライシング活性が炎症アンプの制御に必要であるという結果が得られた。またMeDIP-sequenceによる網羅的解析により、RBMノックダウン細胞において、多くの炎症アンプの関連遺伝子のプロモーターのDNAメチル化上昇が 一方RBM10とp65の会合試験ではN末端、C末端それぞれから削除したRBM10変異体を作成し、免疫沈降法で確認を試みたが、N末端、C末端ともにRBM10とp65の会合が認められたれ、複数の結合部位の存在が考えられた。現在Dnmt3bによるDNAメチル化がp65のプロモーター部位で特異的に亢進するメカニズムが未解決である。したがって現状ではおおむね当初の計画通りに進行しているが、解決すべき課題はまだ残っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究でRBM10によりDnmt3bの活性の変化がp65のプロモーター部位のメチル化に関与する可能性が示唆されたが、直接的な証明ができていない。そこでDnmt3bの各アイソフォームの発現ベクターを作成し、CRISPR/Cas9システムで内在性Dnmt3bを欠失させた細胞に遺伝子導入することによって、Dnmt3bアイソフォーム特異的な細胞を作成する。この細胞を用いて、IL-6、ケモカインの産生、p65のプロモーターへの会合、DNAメチル化、細胞内メチル化活性を比較することにより、Dnmt3bのメチル化活性と炎症アンプとの関係を明らかにする。またDnmt3bによるDNAメチル化がp65のプロモーター部位で特異的に亢進する分子機構を明らかにする。現在Dnmt3bとp65が複合体を形成していることを示唆する結果が得られており、p65がDnmt3bをプロモーター領域に引き寄せている可能性がある。この可能性をChip assayにより検証する。またMeDIP-sequence の結果を用いて、転写因子結合モチーフの解析を行い、転写因子特異性を統計学的に明らかにする。我々は炎症アンプの動物モデルとして関節炎以外にも、乾癬、ベーチェット病、多発性硬化症、ぶどう膜炎モデルが利用できる。これらの動物モデルを用いてRBM10shRNAウイルスの投与、もしくはRBM10ノックアウトマウスを利用して実際の炎症性疾患におけるRBM10の役割を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
申請時の計画では主としてChip-sequence, RNA-sequenceに多くの予算を申請したが、研究の結果Rbm10の機能がDNAメチル化の調節とわかったことからChip-sequence, RNA-sequenceの解析を先延ばしにして、DNAメチル化の解析を優先的に行うこととなった。また研究室の移転に伴い一時的に若干の実験規模の縮小があったため、支出額が減少することとなった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度に先延ばししたChip-sequence, RNA-sequenceを次年度に行い、Rbm10のNfkbシグナルにおける機構をゲノムワイドで明らかにする。またMeDIP-sequenceを新たに行い、DNAメチル化に対するRbm10の機能を検討する。また次年度にはマウスの数が十分確保できると予想されるので、in vivo試験の規模を拡大してin vivoにおけるRbm10の機能をさらに明瞭にする。
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[Journal Article] Temporal Expression of Growth Factors Triggered by Epiregulin Regulates Inflammation Development.2015
Author(s)
Harada, M., D. Kamimura,Y. Arima, H. Kohsaka, Y. Nakatsuji, M. Nishida, T. Atsumi, J. Meng, H. Bando*, R. Singh, L. Sabharwal, J-J. Jiang, N. Kumai, N. Miyasaka, S. Sakoda, K. Yamauchi-Takihara, H. Ogura, T. Hirano and M. Murakami.
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Journal Title
J. Immunol.
Volume: 194(3)
Pages: 1039-1046
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] The Gateway Reflex, which is mediated by the inflammation amplifier, directs pathogenic immune cells into the CNS.2014
Author(s)
Sabharwal, L., D. Kamimura, J. Meng, H. Bando, H. Ogura, C. Nakayama, J-J. Jiang, N. Kumai, H. Suzuki, T. Atsumi, Y. Arima and M. Murakami
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Journal Title
J. Biochem.
Volume: 156(6)
Pages: 299-304
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Inflammation amplifier, a new paradigm in cancer biology.2014
Author(s)
Atsumi, T., R. Singh, L. Sabharwal, H. Bando, J. Meng, Y. Arima, M. Yamada, M. Harada, J-J Jiang, D. Kamimura, H. Ogura, T. Hirano, and M. Murakami
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Journal Title
Cancer Research
Volume: 74(1)
Pages: 8-14
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] The reverse-direction method links mass experimental data to human diseases.2014
Author(s)
Ogura, H., T. Atsumi, H. Bando, L. Sabharwal, M. Yamada, J.-J. Jiang, A. Nakamura, Y. Arima, D. Kamimura, and M. Murakami.
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Journal Title
Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis
Volume: 62(1)
Pages: 41-45
DOI
Peer Reviewed
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