p53変異型癌細胞におけるp73活性化を応用した新規癌治療の基礎研究

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26460624
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 兵頭 一之介 筑波大学, 医学医療系, 教授 (60416469)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 遠藤 慎治 筑波大学, 医学医療系, 講師 (40625919) [Withdrawn] ; 大和 建嗣 筑波大学, 医学医療系, 研究員 (50174751) ; 山本 祥之 筑波大学, 附属病院, 病院講師 (00649288)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: p73活性化 / ΔNp73 / iASPP

Outline of Annual Research Achievements

TP53変異型癌細胞では，アポトーシスや細胞停止のシグナルは他のサブ経路をとるものと思われる。TP73遺伝子はTP53と高い相同性を有し、同様に転写調節因子として腫瘍細胞の増殖抑制効果を示す。これまでの報告では，p73の発現抑制にはMDM2 (murine double minute 2)やΔNp73(p73のN末端トランス活性化ドメイン欠損変異体), iASPP (inhibitory member of the ASPP family)などが関与するとされている。本研究の目的は，TP53変異型消化器癌細胞株において，p73制御分子の発現抑制によるp73の活性化が抗腫瘍効果を発揮するか否かを明らかにすることである。
大腸癌細胞TP53変異株(DLD-1)及び膵癌細胞TP53変異株(Panc-1, MIA Paca-2, BxPC-3)を用い，p73制御分子であるMDM2やΔNp73, iASPPの発現レベルについてWestern blot法にて解析し，これらの発現抑制や機能抑制がp73機能の活性化をもたらす可能性が推測された。MDM2 siRNAを用いてMDM2の発現抑制を行ったところ，Panc-1細胞では著明な増殖抑制効果が認められた。殺細胞性抗がん薬gemcitabineとの併用においても，抗腫瘍効果の増強が認められた。一方で，その他の細胞株では増殖抑制効果は認められず，これらの効果の違いは現時点では明らかではない。そこで、ΔNp73及び iASPP抑制実験のため５種類以上のsiRNA並びにdsRDCを設計，合成し，silencing効果とoff-target効果をコントロールsiRNAと比較検討し、最良のものを選別中である。
また，上記の大腸癌・膵癌細胞株を用いたin vitro実験のためsiRNAのキャリアーとして炭酸アパタイトの使用を検討中である。細胞へのin vitroでの導入効率はlipofectamineを用いた時と遜色がないことを確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初予定していた肝癌細胞株ではsiRNAの導入効率が不良であり，実験対象細胞株を大腸癌や膵癌細胞に変更した。大腸癌及び膵臓癌細胞株でのMDM2, ΔNp73, iASPPの発現解析やnutlin-3やMDM2 siRNAでの抑制実験は終了している。ΔNp73, iASPPのsiRNAの最適配列決定に時間を要しているが、検討材料は揃ったので研究は進められると考えている。

Strategy for Future Research Activity

siRNA並びにdsRDCの合成，選択後，ΔNp73及び iASPP抑制実験を行い腫瘍抑制メカニズム解析の糸口として，p73転写活性の評価を行う。MDM2，ΔNp73及び iASPPの中から，増殖抑制に最も関連する分子を絞り，化学療法薬との併用を含むin vitro実験を推進する。次いで，ヌードマウス担癌モデルを作成し、siRNAを炭酸アパタイトに結合させ、種々の抗がん剤やnutlin-3との併用によるin vivo腫瘍抑制実験を行う。

Causes of Carryover

少額の端数のため使用が困難であった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

事務用品や試薬等の購入に充てる予定。