2015 Fiscal Year Research-status Report
プラズマ刺激を感知する細胞機構の解明―プラズマ医療の推進に向けた分子基盤の確立―
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26460630
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| Research Institution | Gifu Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
原 宏和 岐阜薬科大学, 薬学部, 准教授 (30305495)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
足立 哲夫 岐阜薬科大学, 薬学部, 教授 (40137063)
神谷 哲朗 岐阜薬科大学, 薬学部, 助教 (60453057)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | プラズマ / 活性酸素 / 亜鉛 / がん / 細胞死 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ラジカル、イオン、電子、光などの集合体であるプラズマを大気圧下で安定して生成することが可能となり、現在、この大気圧プラズマを医療に応用する試みが進行している。プラズマ照射培地（plasma-activated medium, PAM）を用いて細胞を間接的にプラズマ刺激したとき、がん細胞が選択的に死滅することから、プラズマ刺激は新しいがん治療法として期待されている。PAMには活性酸素種（ROS）が含まれていることから、PAMによる細胞死ではROSの関与が示唆されている。我々は、昨年度、PAM中のROSにより細胞内亜鉛（Zn2+）プールからZn2+が遊離し、この遊離Zn2+が細胞死を惹起することを報告した。
PAMによる細胞傷害の程度はがん細胞と正常細胞で差異が認められるが、その理由については不明な点が多い。そこで本研究では、正常線維芽細胞とPAMに対して感受性が高いヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞を用いて、その差異について細胞内Zn2+動態の面から検討した。その結果、PAMにより遊離する細胞内Zn2+が多いほど、PAMによる細胞傷害が大きくなることが明らかとなった。
また、肺がん由来のA549細胞に細胞障害を惹起しない低レベルのPAMを短時間曝露したとき、細胞増殖が抑制されることを見出した。この条件下で、がん抑制遺伝子p53タンパク質の細胞内蓄積（分解抑制）が亢進すること、このp53タンパク質の分解抑制に細胞内Zn2+が関与していることを明らかにした。これら結果から、低レベルのPAMを短時間がん細胞に曝露するだけで、抗腫瘍効果が発揮される可能性が示された。
以上の結果から、プラズマという物理的刺激が細胞内遊離Zn2+の増加という亜鉛シグナルに変換されることが、プラズマによる細胞の初期応答に重要であることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細胞へのプラズマ照射には、細胞に直接照射する直接法と、無細胞系でプラズマを照射した培養液（plasma-activated medium；PAM）を用いる間接法がある。本研究では、PAMを使用した間接法を採用し、PAMの細胞傷害と細胞内Zn2+との関連を中心に解析した。
本年度は、正常線維芽細胞とPAMに対して感受性が高いヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞を用いて、PAMによる細胞傷害の差異が生じる理由を細胞内Zn2+動態の面から検討した。PAMは用量依存的にSH-SY5Y細胞の細胞死を引き起こしたが、線維芽細胞ではPAMによる細胞傷害はほとんど認められなかった。PAMによる細胞死は細胞内エネルギー産生障害により生じることから、PAM曝露後の細胞内NAD+およびATP量を測定した。その結果、SH-SY5Y細胞および線維芽細胞においてNAD+は同程度減少したが、ATPの減少はSH-SY5Y細胞でのみ認められた。今回認められたNAD+およびATP量の減少はZn2+キレート剤TPENにより抑制された。また、PAMはSH-SY5Y細胞においてのみアコニターゼ活性を阻害したが、この阻害もTPENにより部分的に回復した。さらに、酸化剤により遊離する細胞内Zn2+の量は、線維芽細胞に比べSH-SY5Y細胞の方が多かった。以上の結果から、PAM による遊離するZn2+レベルの違いが、PAMによる細胞傷害の程度に差が認められる原因の一つであると考えられた。
肺がん由来のA549細胞に細胞障害を惹起しない低レベルのPAMを短時間曝露したとき、細胞増殖が抑制される機序についても検討した。その結果、低レベルPAMで処理したA549細胞はG2/M期で細胞周期が停止すること、がん抑制遺伝子p53タンパク質が発現すること、このp53タンパク質の発現に細胞内Zn2+が関与していることなどを明らかにした。
以上の研究推進状況から判断し、申請者は実験計画がおおむね予定通り進行していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．PAM誘導性の細胞増殖抑制機構の解明
本年度の研究から、低レベルPAMによりA549細胞の細胞増殖が抑制されることが明らかとなった。p53は通常ユビキチン化され、常に分解されているが、抗がん剤などの刺激によりユビキチン化が抑制され、p53タンパク質が細胞内に蓄積する。PAMによりp53の細胞内蓄積が亢進することは確認できたが、その機序については現在も不明である。しかし、Zn2+キレーターTPENがPAMにより誘導されるp53の細胞内蓄積を抑制することから、Zn2+がこの過程に重要な役割を担っていることが推察される。p53の分解抑制には、DNA損傷によるATM/ATRなどのキナーゼの活性化によるp53のリン酸化修飾が重要である。これらの知見から、PAMがDNA損傷を惹起し、その後のATM/ATRの活性化を促進することにより、p53タンパク質の蓄積が誘導されるのではないかと考えられた。そこで、本年度は、PAMによるp53タンパク質の蓄積の過程のどこにZn2+が関与しているのかを解明する。
２．プラズマ照射が皮膚創傷に及ぼす影響
プラズマ照射により皮膚創傷治癒が促進されることが報告されている。そこで、プラズマ照射による皮膚創傷治癒の分子機構を解明するため、プラズマ照射がケラチノサイト（HaCaT細胞）の細胞機能にどのような影響を及ぼすのかを検討する。本年度の予備実験の結果、プラズマ照射は炎症性サイトカインIL-8の発現を亢進することを見出した。IL-8は皮膚創傷の治癒の過程で重要な役割を担っていることが知られている。また、IL-8は酸化ストレスなど様々な刺激により転写レベルでその発現が調節されていることが報告されており、プラズマ照射により生じるROSがこの発現誘導に関与している可能性が推察される。そこで、本年度は、プラズマ照射が、HaCaT細胞においてIL-8発現を亢進する分子機構について検討する。
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| Causes of Carryover |
本年度は、申請者が所属している研究室において当初予定していたより多くの研究費を獲得することができた。本研究室は、プラズマや酸化ストレスに関する研究を展開していることから、使用する試薬などは研究室共通のものも多く、本研究課題で使用する特定の試薬以外の多くの物品（試薬、器具）を共同購入している。それゆえ、当初計画していた本研究課題の研究費を節約することができたため、予算を次年度に繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
課題研究はおおむね順調に進んでいることから、最終年度の研究計画を予定通り進める。
また、次年度は、ブラチスラバ（スロバキア）で行われるプラズマの国際学会に参加・発表（確定）、日本酸化ストレス学会に参加・発表（予定）、日本薬学会に参加・発表（予定）と成果発表のための学会発表を多く予定しているため、出張旅費が本年度に比べ多くの予算が必要になり、その予算を計上した。
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