2015 Fiscal Year Research-status Report

合成ペプチドを用いたHHV-6A、HHV-6B特異抗体測定法の開発

Research Project

Project/Area Number	26460661
Research Institution	Fujita Health University
Principal Investigator	東本祐紀藤田保健衛生大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (20569701)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	榎本喜彦藤田保健衛生大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (00387713) 井平勝藤田保健衛生大学, 保健学研究科, 教授 (10290165) 杉山博子藤田保健衛生大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (10387714) 加藤友理藤田保健衛生大学, 医学部, 研究員 (70726968) 吉川哲史藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (80288472)
Project Period (FY)	2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords	ウイルス学 / 分子生物学 / 国際情報
Outline of Annual Research Achievements	Human herpesvirus 6 (HHV-6) は、現在2種類の種（species）（HHV-6AとHHV-6B）に分けられている。HHV-6Bは小児の一般的な熱性発疹症である突発性発疹症（突発疹）の起因ウイルスであることが明らかになっているが、HHV-6Aの初感染臨床像、血清疫学はともに不明なままである。我々はこれまで、イムノブロット法にてウイルスに特異的な抗原蛋白が各ウイルスに対する特異抗体と反応することを証明した(J Clin Microbiol. 2012 50:1245-51)。本研究では宿主免疫の標的となり、且つ2種類の種間で相同性の低い遺伝子領域で合成ペプチドを作製し、それらを抗原としたELISA法による抗体測定系を確立することを目的とする。我々はHHV-6A, B間で相同性の低い遺伝子領域U11を選択し、さらに蛋白の立体構造解析から細胞表面に現れていると推定される箇所からHHV-6A特異的ペプチド10種類、HHV-6B特異的ペプチド10種類、HHV-6A、B共通ペプチド5種類の合計25種類を作製した。ELISA法の条件設定を行った結果、100倍希釈の血清を使用し、発色時間は30分で行うことで、HHV-6初感染時と再活性化時で最も吸光度差が大きくなることが分かった。より良いELISA法の条件を求め、合成ペプチドに対するキャリア蛋白の付加を試みた。キャリア蛋白を付加することで、合成ペプチドがELISAプレートに立体的に固相化され、抗原抗体反応が起こりやすい状況を作り出すことができる。これにより高感度化が期待される。25種類の合成ペプチドの中からHHV-6A特異的ペプチド3種類、HHV-6B特異的合成ペプチド3種類を選択し、キャリア蛋白を付加してELISA法を実施したが、あまり優位な結果が得られなかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究は合成ペプチドの作製、ELISA法の条件設定、合成ペプチドを用いたHHV-6Aの血清疫学、初感染臨床像の調査に分けることができる。合成ペプチドの作製については、平成26年度にU11遺伝子領域からHHV-6A特異的ペプチド10種類、HHV-6B特異的ペプチド10種類、HHV-6A、B共通ペプチド5種類の合計25種類を作製した。 ELISA法の条件設定については、1次抗体で使用するペア血清の希釈倍率の設定、および発色試薬での発色時間の検討を行った。その結果、血清100倍希釈、発色時間30分で最もペア血清で吸光度の差が大きくなることが分かった。さらにキャリア蛋白を付加し、ELISA法の特異度、高感度化を目指したが、現時点では優位な結果は得られていない。平成28年度はさらにELISA法の条件設定を詰める予定である。キャリア蛋白の付加位置、合成ペプチド（抗原）の濃度設定を中心に、血清との反応性が高い3種類のHHV-6B特異的ペプチドで実施する。
Strategy for Future Research Activity	平成28年度も引き続きELISA法の条件設定を検討する。作成した合成ペプチドのうち、血清との反応性が高い3種類のHHV-6B特異的ペプチドに絞って条件設定を行う予定である。キャリア蛋白はKLH (Keyhole limpet hemocyanin)にし、N末端側もしくはC末端側のどちらに付加した場合に血清との反応が特異的、高感度になるかを検討する。最終的には合成ペプチドを用いたELISA法により、まずは本邦での血清疫学調査を実施する。そのためにまずは本邦の年齢別血清の収集を開始したい。初感染像を解明するために、0歳から5歳まで1歳刻みに収集、その後は5歳刻みに年齢別血清を収集する。各年齢20~30検体の血清について測定する。
Causes of Carryover	平成27年度は概ね順調に計画が進んでいる。ELISA法の条件設定を行ったが、十分な特異的、高感度化を実現できなかった。当初の予定では、条件設定後、多数の臨床検体を用いてELISA法を実施する予定であったが、条件検討でしかELISA法を実施できず、試薬代が安価になってしまったため、次年度使用額が生じてしまった。
Expenditure Plan for Carryover Budget	平成28年においては、平成27年度で実施出来なかったELISA法の条件設定について詳細な部分まで詰める予定である。キャリア蛋白はKLH (Keyhole limpet hemocyanin)にし、N末端側もしくはC末端側のどちらに付加した場合に血清との反応が特異的、高感度になるかを検討する。その後、臨床検体を多数測定したいと考えている。そのため予算通り研究を遂行できると考えている。