2015 Fiscal Year Research-status Report
日本人由来株を用いた高感度ELISA法による猫ひっかき病特異抗体の検出と病態解析
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26460678
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
常岡 英弘 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (40437629)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大津山 賢一郎 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10432741)
柳原 正志 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40379954)
徳田 信子 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (70227578)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | CSD / 猫ひっかき病 / ELISA / CHAPS |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【背景】本研究目的は猫ひっかき病（CSD）の病原菌で培養困難なBartonella henselaeに対する血清抗体価を高感度に測定できるELISA法の確立である。
使用抗原の基礎的研究において、固形培地由来B. henselae菌液からのサルコシン（陰イオン界面活性剤）抽出条件は“37℃下で、0.1％サルコシン液で抽出後の沈渣を再度0.2％サルコシン液で抽出（2～3回）した上清液”が優れていることが判明した。しかしサルコシン抽出液では冷蔵により結晶析出が認められ，その後の操作が煩雑であり，また2次元電気泳動の際、分離に悪影響を与えてしまうなど，今後の研究に不都合が生じることが示唆された。そこで本年度はサルコシンに替わって中性界面活性剤CHAPS使用による抗原精製を中心に研究を進め，B. henselae IgG抗体価測定用高感度ELISAの確立を目指し，CHAPSによる抽出条件の設定を新たに行い，更にはイオン交換カラムクロマトDEAE法とゲルろ過法による抗原精製を行った。
【方法】CHAPS抽出条件を固形培地（チョコレート寒天培地）上のB. henselae ATCC49882株コロニーについて検討した。すなわち5mMHEPES緩衝液（pH7.4）で作成した菌液を洗浄後、沈渣を各条件下（CHAPS濃度・温度）で抽出した。次いで、10,000rpm、30分間超遠心し、その沈渣を再び抽出し、この操作を繰り返した。各上清液をDEAE法およびゲル濾過法で精製後、各液についてCSD患者血清と健常人血清を用いてELISAで抗原性を比較した。
【結果と考察】CHAPS抽出は37℃，0.1%CHAPS液で抽出後の沈査を再度0.5%CHAPS液で抽出した上清液がELISA抗原として優れており，この液をDEAE法およびゲルろ過法で精製することによりその抗原精度が向上することが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
液体培地での多量の抗原作製が予想以上に困難である。これは液体培地での菌液作成中の雑菌混入すること、現段階の液体培地では菌増殖が不十分であることによる。
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| Strategy for Future Research Activity |
1）各種液体培地でのB. henselae菌液の発育状況と抗原性の検討
2）固形培地と各種液体培地とで得た抽出液（サルコシン液あるいはCHAPS液）を精製し、これらを抗原としたELISAで多数の患者血清および健常人血清についてB. henselae IgG抗体価を測定し、抗原の有用性を比較する。
3）2次元電気泳動後、ウエスタンブロット法で解析し、CSD患者血清と特異性が高い代表的な蛋白質を抗原液から選出する。選出したタンパク質スポットを切り出し質量分析によりタンパク質を同定する。
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| Causes of Carryover |
研究が予定よりやや難航し、遅れているため
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
最終年度の予算と一緒により効率的に研究を進めたい。
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Research Products
(5 results)
