2015 Fiscal Year Research-status Report
全ゲノム解析と質量分析による抗酸菌の新たな分類同定法の確立
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26460686
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| Research Institution | Kyorin University |
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Principal Investigator |
松島 早月 杏林大学, 医学部, 実験助手 (80231596)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
渡邊 卓 杏林大学, 医学部, 教授 (00191768)
大塚 弘毅 杏林大学, 医学部, 助教 (70439165)
大西 宏明 杏林大学, 医学部, 教授 (80291326)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 非結核性抗酸菌 / 全ゲノム解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
27年度は、研究計画に基づき、以下の研究を実施した。
【１】抗酸菌DNAの抽出法の検討
全ゲノム解析を行うための次世代シークエンサーに使用するDNAは、通常のPCR等に使用するDNAに比べ高純度でかつ損傷の少ないものが要求される。抗酸菌は、ミコール酸などの特有の膜構造をもつため、薬剤に対する抵抗性が高く、他の菌に比べ純粋なDNAの抽出が困難であることが知られている。昨年度、改良したDNA抽出法により、Mycobacterium kyorinenseおよびMycobacterium celatum type 1の高純度のDNAを抽出し、次世代シークエンサーION PGMを用いて全ゲノム解析を行った。しかしながら、DNAの質が十分でなく、得られた結果でM. kyorinenseでは453, M. celatumでは1217のcontigに分かれた。そのため、一部の薬剤耐性遺伝子については解析できたものの、系統解析を行うに十分な全ゲノムの完全なデータは得られなかった。特に、M. celatumの解析結果については、Genome Announcements誌に投稿したものの、contigが多いため不完全なデータとされて掲載に至らなかった。その後、M. celatumについては、さらに純度の高いDNAを得るために、別のキットを使用するなどを試みたが、十分な純度のDNAが得られなかった。また、このDNAの全ゲノム解析を外部委託したが、やはり解析困難という結果であった。
【２】質量分析による蛋白プロファイルの解析
M. kyorinenseについて、抗酸菌用細胞膜破砕装置（ヒートビーズシステムHBWK-1）を用いて、蛋白液を抽出した。抽出した蛋白液を用いて、質量分析装置（MALDI Biotyper）により、蛋白プロファイルの分析を行ったところ、ピークが表出されず、解析困難であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
DNA抽出法の開発に時間を要したため、現状で全ゲノム解析を施行できたのは２菌種にとどまっており、そのデータも不完全であるため、さらなるDNA抽出法の開発に時間を要している。また、質量分析についても、解析結果が得られず、抽出した蛋白液の純度の問題があると考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、当初の研究計画通り、抗酸菌の全ゲノム解析をさらに他の菌種に関しても施行する予定である。そのために、追加で非結核性抗酸菌の菌株を入手する。また、全ゲノム解析に使用できるような高純度のDNA抽出法の開発を急ぐ。全ゲノム解析で得られたデータをもとに、抗酸菌の系統分類についての新たな知見を得ることを目指す。一方、質量分析についても、蛋白抽出法を改良することにより、解析結果が得られるよう努める。これらの解析により得られた全ゲノムデータおよび蛋白プロファイルを用いて、臨床検体を対象とした菌種同定能の検討を行う。
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| Causes of Carryover |
研究の遅れにより、当初購入予定であった抗酸菌株を一部まだ購入していない。また、これらの菌株のDNA抽出・蛋白抽出や全ゲノム解析・蛋白分析に用いるはずであった費用も未使用である。また、学会発表の旅費分も使用していない。これらの理由により、未使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今後、抗酸菌株を追加で購入し、DNA抽出・全ゲノム解析および蛋白抽出・質量分析を行うことにより、２７年度の余剰分は当初の予定通りの目的に使用できる見込みである。
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